一種量子點標(biāo)記的血紅素鐵的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種量子點標(biāo)記的血紅素鐵的制備方法。(1)將油溶性量子點用無水乙醇洗，然后將其與修飾試劑PEG-NH2溶于氯仿，放入燒瓶中，超聲，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽除氯仿，再加入B.R.緩沖液，吸出溶液，先過微米濾膜，再超濾，得到QDs-NH2；(2)將QDs-NH2與Hemin按物質(zhì)的量比（1∶20）～（1∶80）加到PBS緩沖液中，然后加入連接劑EDC，在水平搖床上避光反應(yīng)3h，再將反應(yīng)液移入超濾管超濾，剩余液體即產(chǎn)物量子點標(biāo)記的血紅素鐵QDs-Hemin。QDs-Hemin穩(wěn)定性好，在體和細(xì)胞實驗均證實其可用于研究血紅素鐵的體內(nèi)外吸收機(jī)制。
【專利說明】-種量子點標(biāo)記的血紅素鐵的制備方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種血紅素鐵的制備方法，特別是一種量子點標(biāo)記的血紅素鐵的制備 方法及其在體內(nèi)外示蹤血紅素鐵吸收方面的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 鐵是人體必需的微量元素之一，人體鐵缺乏會導(dǎo)致貧血、智障等疾病。據(jù)世界衛(wèi)生 組織統(tǒng)計，全球缺鐵性貧血患者已達(dá)10億人，這給人類的健康生活帶來很大的威脅。鐵主 要通過飲食獲得，食物中的鐵主要分非血紅素鐵和血紅素鐵。小腸是鐵吸收的唯一部位，機(jī) 體主要通過控制小腸鐵吸收達(dá)到鐵代謝平衡，以保證各種生理過程正常進(jìn)行。目前，非血紅 素鐵的小腸吸收機(jī)制已明確，而對于血紅素鐵的小腸吸收機(jī)制還不清楚。血紅素鐵，即嚇啉 鐵，由原卟啉與一分子Fe2+構(gòu)成，是生物態(tài)鐵。血紅素鐵來源于肉類食品中的肌紅蛋白和血 紅蛋白，如動物肝臟、瘦肉和魚等，因此血紅素鐵的生物利用率Γ25%)高，機(jī)體約有2/3的 鐵靠攝取血紅素獲得。據(jù)研究估計，雖然血紅素鐵只占攝入總量的1/3,但來自血紅素的鐵 占人均總鐵的2/3。血紅素鐵可直接被小腸上皮細(xì)胞吸收，不產(chǎn)生消化道刺激，對于缺鐵導(dǎo) 致的疾病，用補(bǔ)血紅素鐵來治療應(yīng)該是一種更為有效的手段，但其吸收機(jī)制不清楚，一味地 補(bǔ)鐵，不但達(dá)不到有效的治療目的，還有可能造成鐵過多而導(dǎo)致其它疾病。因此，鐵吸收機(jī) 制的研究，尤其是血紅素鐵的吸收機(jī)制研究日益重要。
[0003] 對于血紅素鐵吸收機(jī)制的研究，目前主要采用同位素（55Fe、59Fe、 14C)標(biāo)記技術(shù)，但 同位素會對人體產(chǎn)生很大傷害。為了避免使用同位素帶來的傷害，尋找一種替代技術(shù)用于 解決同位素標(biāo)記帶來的傷害具有重要意義。量子點（quantum dots, QDs)是一種新型的突光 標(biāo)記試劑，具有獨特的熒光性質(zhì)：熒光發(fā)射波長可控、熒光強(qiáng)度高、光穩(wěn)定性好、耐光漂白、 能實現(xiàn)一元激發(fā)多元發(fā)射等，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)上已被用于細(xì)胞、活體等靶向定位、免疫熒光標(biāo) 記、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活體成像探針等。其中，核殼結(jié)構(gòu)的CdSe/ZnS量子點，具有量子產(chǎn)率高、光學(xué) 性能穩(wěn)定等特點，在生物學(xué)中被廣泛應(yīng)用。而對于以CdSe/ZnS為熒光標(biāo)簽，研究血紅素鐵 的吸收機(jī)制未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種量子點（QDs, CdSe/ZnS)標(biāo)記血紅素鐵的制備方法， 該方法所得到的產(chǎn)物（QDs-Hemin)，在生理條件下穩(wěn)定性好，在體和細(xì)胞實驗均證實， QDs-Hemin可用于研究血紅素鐵的體內(nèi)外吸收機(jī)制，解決了目前常用同位素作標(biāo)記對人體 危害大的缺陷。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采取的技術(shù)方案是這樣的： 本發(fā)明利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備量子點標(biāo)記的血紅素鐵（QDs-Hemin),在QDs-NH2與Hemin 按物質(zhì)的量比采用（1:20)?（1:80)時，均可制得產(chǎn)物。所得產(chǎn)物在生理條件下穩(wěn)定性好， 在體和細(xì)胞實驗均證實，QDs-Hemin可用于研究血紅素鐵的體內(nèi)外吸收機(jī)制。
[0006] 具體的，本發(fā)明的量子點（QDs, CdSe/ZnS)標(biāo)記的血紅素鐵的制備方法包括如下 步驟： (1) 將油溶性量子點用無水乙醇洗1次，條件是12000 rpm，5 min，然后將其與修飾試 齊IJPEG-NH2-同溶于氯仿，放入圓底燒瓶中，超聲l~2min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽除氯仿，再往圓底 燒瓶中加入B. R.緩沖液，控制pH=8. 4,吸出溶液，先過0. 22微米的濾膜，再放入100 KD的 超濾管中超濾，即得到水溶性的QDs_NH2 ; (2) 將步驟（1)所得到的QDs-NH2與Hemin按物質(zhì)的量比（1 :20)?（1 :80)比例添加 到pH=7. 4的PBS緩沖液中，然后加入連接劑EDC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亞 胺)，在水平搖床上避光反應(yīng)3h，再將反應(yīng)液移入超濾管，7000 rpm，5 min超濾，剩余液體就 是產(chǎn)物量子點-血紅素鐵QDs-Hemin。
[0007] 本發(fā)明取得的有益效果如下： 本發(fā)明制備的QDs-Hemin，用于研究血紅素鐵的體內(nèi)外吸收機(jī)制，可以揭示血紅素鐵在 Caco-2細(xì)胞的吸收機(jī)制，完善小腸鐵吸收理論，同時豐富了鐵代謝理論，為人體鐵紊亂相關(guān) 疾病的預(yù)防、治療和藥物開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1 :QDS-Hemin的紫外吸收和熒光發(fā)射圖譜。
[0009] 圖1A分別為QDs_NH2、Hemin和QDs-Hemin的紫外-可見吸收光譜。從圖中可看 至丨J，QDs_NH2的特征吸收為579 nm，Hemin的特征吸收為390 nm和600 nm，分別是soret帶 吸收和Q帶吸收，在產(chǎn)物QDs-Hemin中同時出現(xiàn)了 QDs的特征吸收和Hemin的soret帶特 征吸收，由此可證明該物質(zhì)是QDs和Hemin的偶聯(lián)物。圖1B是QDs、QDs_NH2和QDs-Hemin 的熒光發(fā)射峰，由于油溶性QDs表面被成功修飾上-NH2和Hemin，所以相應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射 峰產(chǎn)生了紅移。
[0010] 圖2 :QDs_Hemin的粒徑分布和zeta電位圖。
[0011] QDs-Hemin的粒徑分布采用動態(tài)光散射（DLS)技術(shù)測定，如圖2A所示。從圖中可 以看出，QDs-Hemin的粒徑大小450 nm，這是由于在產(chǎn)物QDs-Hemin中，QDs的表面有殘留 的-NH2，不同的QDs表面-NH2與-NH2之間形成了氫鍵，導(dǎo)致產(chǎn)物的動態(tài)光散射粒徑較大。
[0012] Zeta電位是表征分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。從圖2B可以看出，QDs-Hemin的Zeta 電位為-28 mV，表明采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備的QDs-Hemin穩(wěn)定性較好。
[0013] 圖3 :QDs_Hemin在pH及NaCl中的穩(wěn)定性。
[0014] 圖3A和圖3B是QDs-Hemin在pH值為5-9的R.緩沖液及不同離子強(qiáng)度的NaCl 溶液（0、0.05、0.15、0.45、11〇中的熒光強(qiáng)度。從圖中看到008-他11^11不受？!1值和離子強(qiáng) 度的影響，可適用于生物體系。
[0015] 圖4 :QDs-Hemin在Caco-2細(xì)胞中的吸收。
[0016] Caco-2細(xì)胞(人直腸癌細(xì)胞)在形態(tài)學(xué)及生化性質(zhì)都與小腸上皮很相似，其模型已 被廣泛地應(yīng)用于體外營養(yǎng)物質(zhì)分子腸吸收的研究。將QDs-Hemin分別孵育Caco-2細(xì)胞20 min、40 min、60 min、80 min,然后在多功能酶標(biāo)儀上進(jìn)行胞內(nèi)突光強(qiáng)度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從20 min開始熒光強(qiáng)度就有極顯著地增加，到60 min熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，80 min變化不明顯， 說明60 min細(xì)胞已完成對QDs-Hemin的吸收。
[0017] 圖5 :QDs-Hemin在小腸十二指腸的吸收。
[0018] 對正常的昆明小鼠進(jìn)行十二指腸灌入QDs-Hemin 40 min后，取材，做冰凍切片，用 同步輻射微束X射線熒光光譜法測定Fe和Zn元素的含量(顏色深度不同，表示元素含量 多少不同）。從圖5可知，無論對切片中的Fe (來自Hemin)定位（圖5A)，還是對Zn (來自 QDs)定位（圖5B)，所得到的圖譜一致，即十二指腸吸收QDs-Hemin后，F(xiàn)e和Zn共定位，這 說明QDs-Hemin能夠進(jìn)入十二指腸，并以整體形式被小腸吸收。

【具體實施方式】
[0019] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實施例的限制。
[0020] 實施例1制備量子點標(biāo)記血紅素鐵 將油溶性量子點用無水乙醇洗1次（12000 rpm，5 min)，然后將其與修飾試劑 (PEG-NH2)溶于氯仿，放入圓底燒瓶中，超聲l~2min。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽除氯仿，再往圓底燒 瓶中加入B. R.緩沖液（pH=8. 4)，吸出溶液，先過0. 22微米的濾膜，再放入100 KD的超濾管 中超濾，即得到水溶性的QDs-NH2。
[0021] 將QDs-NH2與Hemin按1 :20加到PBS緩沖液中，然后加入連接劑EDC (1-乙 基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亞胺)，在水平搖床上避光反應(yīng)3h。再將反應(yīng)液移入超濾管， 7000 rpm，5 min超濾，剩余液體就是產(chǎn)物，即量子點-血紅素鐵的偶聯(lián)物QDs-Hemin。
[0022] 實施例2 QDs-Hemin的生理穩(wěn)定性實驗 配制一系列pH值為5~9的B. R.緩沖液，將QDs-Hemin加入到不同pH值的B. R.緩沖 液中，靜置15h后，用熒光分光光度計分別測試QDs-Hemin在不同pH值溶液中的熒光強(qiáng)度， 激發(fā)波長為360 nm，考察pH值對QDs-Hemin熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，QDs-Hemin熒光 強(qiáng)度不受pH值的影響，可用于生物體系。
[0023] 配制一系列濃度為0、0. 05、0. 15、0. 45、1 Μ的NaCl溶液，將QDs-Hemin加入到上述 不同離子強(qiáng)度的溶液中靜置15h后，用熒光分光光度計分別測試QDs-Hemin在不同離子強(qiáng) 度溶液中的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為360nm，考察離子強(qiáng)度對QDs-Hemin熒光強(qiáng)度的影響。結(jié) 果表明，QDs-Hemin熒光強(qiáng)度不受離子強(qiáng)度的影響，可用于生物體系。
[0024] 實施例3 QDs-Hemin在Caco-2細(xì)胞中的吸收 Caco-2細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基，同時加入20%的胎牛血清，終濃度為100IU/ml的青霉素 和100 μ g/ml鏈霉素。細(xì)胞在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C、5%C02、95%空氣、100% 相對濕度。每5飛天按照1:4的比例傳代，每三天換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到709Γ80%時， 換成基本培養(yǎng)基。同時加入QDs-Hemin孵育細(xì)胞。分別在37°C孵育Caco-2細(xì)胞20min、 40min、60min、80min，然后吸出培養(yǎng)液，用PBS洗三次，用多功能酶標(biāo)儀定量檢測進(jìn)入細(xì)胞 內(nèi)的QDs-Hemin。結(jié)果表明，60 min時，細(xì)胞已完成對QDs-Hemin的吸收。
[0025] 實施例4 QDs-Hemin在小腸十二指腸的吸收 腹腔注射戊巴比妥鈉微麻醉小鼠，將其固定于泡沫板上，剪開腹部，從距胃幽門部1~2 cm處開始用細(xì)繩結(jié)扎，再距此結(jié)扎點:Γ4 cm處作為結(jié)扎的第二個部位，做成十二指腸圈， 用注射器向腸圈內(nèi)注射QDs-Hemin至腸圈適度擴(kuò)張為止，40 min后取材。用4%的多聚甲 醛固定液沖洗、固定十二指腸圈，4°C保存。再將組織浸泡于30%的蔗糖中，進(jìn)行冰凍橫切 片，-20°C保存?zhèn)溆谩２捎猛捷椛湮⑹鳻射線熒光法定量測定QDs和Hemin的含量。結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，十二指腸吸收QDs-Hemin后，F(xiàn)e和Zn共定位，說明QDs-Hemin能夠進(jìn)入十二指腸， 并以整體形式被小腸吸收。
[0026] 以上實施例證實：本發(fā)明制備的量子點標(biāo)記的血紅素鐵QDs-Hemin，在生理條件 下，穩(wěn)定性好，可用于研究血紅素鐵的體內(nèi)外吸收機(jī)制，特別是用于體內(nèi)外示蹤血紅素鐵吸 收方面的應(yīng)用。
[0027] 本發(fā)明中使用的化學(xué)物質(zhì)的縮寫式如下(物質(zhì)的化學(xué)名稱）： QDs :量子點 CdSe/ZnS :以硒化鎘（CdSe)為核，硫化鋅（ZnS)為殼的核殼型量子點 Hemin :氯化高鐵血紅素 QDs-Hemin :量子點-氯化高鐵血紅素偶聯(lián)物 QDs-NH2 :氨基修飾的水溶性量子點 PEG-NH2 :氨基修飾的聚乙二醇 EDC :1_乙基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亞胺 Caco_2 :人直腸癌細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1. 一種量子點標(biāo)記的血紅素鐵的制備方法，其特征是包括如下步驟： (1) 將油溶性量子點用無水乙醇洗1次，條件是12000 rpm，5 min，然后將其與修飾試 齊IJPEG-NH2-同溶于氯仿，放入圓底燒瓶中，超聲l~2min，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽除氯仿，再往圓底 燒瓶中加入pH=8. 4的B. R.緩沖液，吸出溶液，先過0. 22微米的濾膜，再放入100 KD的超濾 管中超濾，得到水溶性的QDs-NH2 ; (2) 將步驟（1)所得到的QDs-NH2與Hemin按物質(zhì)的量比（1 :20)?（1 :80)比例添加 到pH=7. 4的PBS緩沖液中，然后加入連接劑1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基）碳二亞胺，在 水平搖床上避光反應(yīng)3h，再將反應(yīng)液移入超濾管，7000 rpm，5 min超濾，剩余液體為產(chǎn)物量 子點標(biāo)記的血紅素鐵QDs-Hemin。
2. -種量子點標(biāo)記的血紅素鐵的應(yīng)用，其特征是其在體內(nèi)外示蹤血紅素鐵吸收的應(yīng) 用。
【文檔編號】C09K11/02GK104059626SQ201410293596
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】耿麗娜, 于鵬, 王嚴(yán), 常彥忠, 段相林 申請人:河北師范大學(xué)