專利名稱：一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)及生物技術(shù)交叉領(lǐng)域，特別是一種樹枝狀有機(jī)熒光染 料生物探針及制備方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，癌癥已成為威脅人類健康的第一殺手，如何有效地控制其 發(fā)生和發(fā)展已成為當(dāng)務(wù)之急。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在腫瘤的防治中，腫瘤得到 二級預(yù)防，即早査、早診、早治將是未來相當(dāng)長時期實(shí)體瘤獲得大幅度提 高療效的方向。由于分子生物標(biāo)記具有價廉、安全、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué) 早期診斷方面越來越受到人們的關(guān)注。目前該技術(shù)已在癌癥和艾滋病的識 別方面有較好的應(yīng)用。
生物熒光探針在生物領(lǐng)域的相關(guān)檢測方法和技術(shù)與傳統(tǒng)的同位素檢測 相比具有速度快、重復(fù)性好、用量少及無輻射等特點(diǎn)。目前用于細(xì)胞標(biāo)記 的生物熒光顏料探針主要有吖啶、菲啶類、熒光素類，二氟烷硼類，二苯 乙烯類、萘酰亞胺類、菁染料類等。但除菁染料類外，其他染料自身都會 產(chǎn)生強(qiáng)的熒光背景干擾。作為生物熒光探針，如何在增大其靈敏度的同時 提高光穩(wěn)定性，減少熒光猝滅，并使其具有很好的癌細(xì)胞靶向性，是生物 熒光染料探針修飾研究的關(guān)鍵問題。
樹枝狀化合物是一種結(jié)構(gòu)完整、高度枝化的大分子。其分子在結(jié)構(gòu)上 具有高度的幾何對稱性、精確的分子結(jié)構(gòu)、大量的官能團(tuán)、分子內(nèi)存在空 腔及分子鏈增長具有可控性等特點(diǎn)，廣泛用于醫(yī)學(xué)、催化、染料、生物材 料等領(lǐng)域。由于樹枝狀化合物的中心以及內(nèi)部存在活性點(diǎn)，在這些活性點(diǎn) 上接上熒光染料探針分子，可制備出樹枝狀有機(jī)熒光染料探針，該探針有
4特定的空間、立體結(jié)構(gòu)，且具備良好的穩(wěn)定性和熒光特性。樹枝狀化合物 具有大量的反應(yīng)活性點(diǎn)，可以進(jìn)行各種功能基轉(zhuǎn)化，功能化位點(diǎn)不同，樹 枝狀化合物表現(xiàn)出的性質(zhì)也有所不同，如外層功能化時，官能團(tuán)直接鍵接 到樹枝狀化合物的表面，負(fù)載量大，局部濃度高，有時還表現(xiàn)出官能團(tuán)之 間的協(xié)同效應(yīng)。樹枝狀化合物官能團(tuán)之間可實(shí)現(xiàn)相互隔離，表現(xiàn)出"高度 稀釋效應(yīng)"。在以上研究基礎(chǔ)上，擬在多糖分子上組裝不同級次的樹枝狀 化合物并用于修飾菁染料，研究染料-多糖化合物由線狀改變?yōu)榱Ⅲw結(jié)構(gòu) 后，將提高對探針分子熒光增強(qiáng)的貢獻(xiàn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種樹枝狀有機(jī)熒光染料探針及其制備方法，有 利于提高探針的光穩(wěn)定性，同時增加染料與細(xì)胞的生物相容性以及在于生
物組織結(jié)合及成像時表現(xiàn)出熒光加合效應(yīng)，使探針分子與DNA或細(xì)胞相互 作用的光學(xué)靈敏度得到顯著提高。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種樹枝狀有機(jī)熒光
染料生物探針，其特征是該生物探針結(jié)構(gòu)包括在一個殼聚寡糖分子上連
接1至15個樹枝狀有機(jī)熒光染料分子，同時再與一個葉酸分子結(jié)合形成的 探針。 本發(fā)明同時還提供一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針的制備方法。
本發(fā)明的效果為
1. 本發(fā)明生物探針制備方法簡單，對變異細(xì)胞初步表示研究表明，該探 針具有較好的標(biāo)記靶向性，為采用該類生物探針標(biāo)記變異細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)效關(guān) 系研究提供了一種方法。
2. 對檢測物的毒性低，靈敏度高，使用量少。由于一個殼聚寡糖分子上 可連接眾多樹枝狀有機(jī)熒光染料分子，本發(fā)明探針在標(biāo)記過程中表現(xiàn)出明 顯的熒光加合效應(yīng)，在提高其光穩(wěn)定性的同時增大了其標(biāo)記靈敏度，使用量減少。
3. 樹枝狀化合物的應(yīng)引入，使熒光染料分子之間的距離增大，從而減少
熒光染料分子相互碰撞猝滅的幾率，增強(qiáng)了光穩(wěn)定，起到熒光加合效應(yīng)， 同時，增加了生物探針和細(xì)胞的生物相容性。
4. 具有光譜范圍廣、摩爾消光系數(shù)大、無熒光背景、兩資產(chǎn)率高和靈敏 度高等特點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明的探針的葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料結(jié)構(gòu)簡圖； 圖2為本發(fā)明的樹枝狀有機(jī)熒光染料-殼聚寡糖-葉酸探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖以及實(shí)施例進(jìn)一步對本發(fā)明的一種樹枝狀有機(jī)熒光染料 生物探針及其制備方法加以說明，但不局限于本發(fā)明。
本發(fā)明的一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針是基于以殼聚寡糖分子作 為葉酸配體和樹枝狀染料分子之間的橋梁，增加了染料的細(xì)胞相容性、降 低了對生物標(biāo)記物的毒性。且由于殼聚寡糖具有很好的化學(xué)活性，很容易 對其進(jìn)行化學(xué)改性并修飾具有特定基團(tuán)的熒光染料，和可根據(jù)特定的對象 選擇合適的生物分子進(jìn)行修飾，如修飾配體定位受體及修飾探針DNA檢測 目標(biāo)DNA等。樹枝狀化合的引入提高了生物探針的靈敏度、降低了探針標(biāo) 記的使用量，同時也提高了探針分子的生物相容性。
本發(fā)明的一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針，該生物探針結(jié)構(gòu)包括在 一個殼聚寡糖分子上連接1至15個樹枝狀有機(jī)熒光染料分子，同時再與一 個葉酸分子結(jié)合形成的探針。
所述樹枝狀有機(jī)熒光染料是由一個樹枝狀化合物(dendrimer)分子與 2 8個熒光染料連接而成。所述殼聚寡糖(chitosan)分子的分子量為195 6000，所述殼聚寡糖分子的分子量也可為為200 2000。本發(fā)明的樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針的制備方法包括有以下步驟
1) 樹枝狀有機(jī)熒光染料的制備
① 將摩爾比為1: 3的2，2-二甲氧基乙胺及丙烯酸甲酯，置于甲醇溶劑 中，攪拌均勻，在溫度為35 50°C的條件下反應(yīng)兩天，用柱層析分離，得 到甲基酯化合物l;
② 取摩爾比為1: 3的上述甲基酯化合物1及乙二胺溶于甲醇溶劑，置 于反應(yīng)瓶中攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)2 3天，用油泵抽濾除去過量的
乙二胺，得到一代樹枝狀化合物2。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)；
③ 取摩爾比為1: 2的上述第一代樹枝狀化合物2及熒光染料，溶于甲 醇溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)2 3天，析出紅色針狀晶體；
重復(fù)一次上述①、②步驟的化學(xué)反應(yīng)，得到二代樹枝狀化合物；二代 樹枝狀化合物與熒光染料反應(yīng)可得到二代樹枝狀有機(jī)熒光染料；
2) 殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料的制備
① 取適量樹枝狀有機(jī)熒光染料固體溶于摩爾比為0.03: 1的三氟醋酸 和鹽酸溶液中，室溫攪拌，室溫攪拌1天后，將攪拌的混合物旋蒸，干燥 徹底后，得到醛基樹枝狀有機(jī)熒光染料；
② 將80 100mg聚氨基多糖溶于含有適量冰醋酸水溶液中，向其中加入 上述2)中①步驟制得的醛基樹枝狀有機(jī)熒光染料，得到混合物；向該混合 物中加入25 30mL甲醇進(jìn)行稀釋，并室溫攪拌充分后，加入100 120 mg 氰基硼氫化鈉，并繼續(xù)攪拌l天；
③ 經(jīng)上述②步驟反應(yīng)后的混合液用100 150mL的飽和碳酸氫鈉溶液和 丙酮處理，得到沉淀后的沉淀物通過過濾收集，將收集到的沉淀物分散在 5 10mL的lmol/L的氫氧化鉀水溶液中，滲析2 3天，在_8 -15。C溫度 下凍干，得到殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料；
3)葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料探針的制備
7將上述2)制備的殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料的干品與葉酸按摩爾
比為1: 1溶解于二甲基亞砜溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)10小時后加入乙
醚，產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過濾所得到的沉淀物用乙醚洗滌后于25 35。C下真空 干燥，即得葉酸-可殼寡糖-樹枝狀化熒光染料探針干品。 所述熒光染料的簡式為TO-C00H， CY3-C00H。
實(shí)施例1:葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針I(yè)號的制備。
1.制備樹枝狀有機(jī)熒光染料 (1)將3g (28.6腿o1) 2，2-二甲氧基乙胺及30ml甲醇置于50ml圓底 燒瓶，攪拌均勻，加入9.8g丙烯酸甲酯，在溫度為50。C的條件下反應(yīng)48h， 停止反應(yīng)，用減壓旋蒸儀除去溶劑，殘留物進(jìn)行柱層析分離，得到甲基酯 化合物1。
(2 )取1. 0g甲基酯化合物1溶于15mL甲醇，加入1. 5g乙二胺，置 于50mL反應(yīng)瓶中攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)3d，用油泵抽濾除去過量的 乙二胺，得到一代樹枝狀化合物2。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)。
(3 )取65. 5mg化合物2及20mg羧基T0，溶于30mL的甲醇溶液，置 于50mL圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)3d，析出得樹枝狀有機(jī)熒光 染料。
2 .制備殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料
① 將1. 15mmo1樹枝狀有機(jī)熒光染料溶于4. 9g三氟醋酸和16. 85mL的 2M鹽酸溶液中，室溫攪拌。室溫攪拌l天后，混合物旋蒸，干燥徹底后得 到醛基樹枝狀有機(jī)熒光染料；
② 將100mgNH2聚氨基多糖溶于含有30mg醋酸0. 5mmo1的10mL水溶液 中，向其中加入上步制得的醛基樹枝狀有機(jī)熒光染料，得到混合物。向混 合物中加入30mL甲醇進(jìn)行稀釋，并室溫攪.拌1小時后，加入120mg氰基硼 氫化鈉，并繼續(xù)攪拌l天。
8③反應(yīng)后的混合液用5 mL的飽和碳酸氫鈉溶液和100mL的丙酮處理， 得到沉淀后。沉淀通過過濾收集，將收集到的沉淀分散在5mL的lmol/L的 氫氧化鉀水溶液中，滲析2天，在-15°C溫度下凍干得到殼聚寡糖-樹枝狀 有機(jī)熒光染料。
3.葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料探針的制備
將上述殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料干品與0.02mmo1葉酸(flate acid)溶解于10ml 二甲基亞砜(DMSO)溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)10小 時后加入乙醚，產(chǎn)生沉淀，過濾；所得到沉淀用乙醚洗滌后于25-35T:下真 空干燥，即得葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀化熒光染料探針干品。
實(shí)施例2:葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針I(yè)I號的制備。
將實(shí)施例l步驟l變?yōu)?br> 1.制備樹枝狀有機(jī)熒光染料
(1)將3g (28. 6mmo1) 2， 2-二甲氧基乙胺及30ml甲醇置于50ml圓底 燒瓶，攪拌均勻，加入9. 8g丙烯酸甲酯，在溫度為50°C的條件下反應(yīng)48h， 停止反應(yīng)，用減壓旋蒸儀除去溶劑，殘留物進(jìn)行柱層析分離，得到甲基酯 化合物1。
(2 )取1. 0g甲基酯化合物1溶于15mL甲醇，加入1. 5g乙二胺，置 于50mL反應(yīng)瓶中攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)3d，用油泵抽濾除去過量的 乙二胺，得到一代樹枝狀化合物2。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)。
(3 )取33. 3mg —代樹枝狀化合物2及30ml甲醇置于50ml圓底燒瓶， 攪拌均勻，加入35.4mg丙烯酸甲酯，在溫度為50°C的條件下反應(yīng)48h，停 止反應(yīng)，用減壓旋蒸儀除去溶劑，殘留物進(jìn)行柱層析分離，得到甲基酯化 合物3。
(4)取66. 7mg甲基酯化合物3溶于30mL甲醇，加入60mg乙二胺， 置于50mL反應(yīng)瓶中攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)3d，用油泵抽濾去過量的
9乙二胺，得到二代樹枝狀化合物4。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)。
(5)取103. 6mg羧基T0，溶于30mL的甲醇溶液，置于50mL圓底燒瓶 中，緩慢滴加入78. 9mg 二代樹枝狀化合物4，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)3d， 析出得二代樹枝狀有機(jī)熒光染料。
其余步驟不變，得到葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針I(yè)I號。
實(shí)施例3:葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針ni號的制備。
將實(shí)施例1步驟1的(3)中熒光染料TO-C00H換成同摩爾的CY:「C00H， 其余步驟不變，得到葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針I(yè)II號。
權(quán)利要求
1.一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針，其特征是該生物探針結(jié)構(gòu)包括在一個殼聚寡糖分子上連接1至15個樹枝狀有機(jī)熒光染料分子，同時再與一個葉酸分子結(jié)合形成的探針。
2. 根據(jù)權(quán)利1要求所述樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針，其特征是所述樹枝狀有機(jī)熒光染料是由一個樹枝狀化合物(dendrimer)分子與2 8 個熒光染料連接而成。
3. 根據(jù)權(quán)利1要求所述樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針，其特征是所 述殼聚寡糖(chitosan)分子的分子量為195 6000。
4. 根據(jù)權(quán)利1要求所述樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針，其特征是所 述殼聚寡糖分子的分子量為200 2000。
5. 根據(jù)權(quán)利1要求所述樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針的制備方法，該 制備方法包括有以下步驟1) 樹枝狀有機(jī)熒光染料的制備① 將摩爾比為1: 3的2，2-二甲氧基乙胺及丙烯酸甲酯，置于甲醇溶劑 中，攪拌均勻，在溫度為35 50°C的條件下反應(yīng)兩天，用柱層析分離，得 到甲基酯化合物l;② 取摩爾比為1: 3的上述甲基酯化合物1及乙二胺溶于甲醇溶劑，置 于反應(yīng)瓶中攪拌，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)2 3天，用油泵抽濾除去過量的 乙二胺，得到一代樹枝狀化合物2。產(chǎn)物直接用于下一步反應(yīng)；③ 取摩爾比為1: 2的上述第一代樹枝狀化合物2及熒光染料，溶于甲 醇溶劑，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，避光反應(yīng)2 3天，析出紅色針狀晶體；重復(fù)一次上述①、②步驟的化學(xué)反應(yīng)，得到二代樹枝狀化合物；二代 樹枝狀化合物與熒光染料反應(yīng)可得到二代樹枝狀有機(jī)熒光染料；2) 殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料的制備① 取適量樹枝狀有機(jī)熒光染料固體溶于摩爾比為0.03: 1的三氟醋酸 和鹽酸溶液中，室溫攪拌，室溫攪拌1天后，將攪拌的混合物旋蒸，干燥 徹底后，得到醛基樹枝狀有機(jī)熒光染料；② 將80 100mg聚氨基多糖溶于含有適量冰醋酸水溶液中，向其中加入 上述2)中①步驟制得的醛基樹枝狀有機(jī)熒光染料，得到混合物；向該混合 物中加入25 30 mL甲醇進(jìn)行稀釋，并室溫攪拌充分后，加入100 120 mg 氰基硼氫化鈉，并繼續(xù)攪拌l天；③ 經(jīng)上述②步驟反應(yīng)后的混合液用100 150mL的飽和碳酸氫鈉溶液和 丙酮處理，得到沉淀后的沉淀物通過過濾收集，將收集到的沉淀物分散在 5 10mL的lmol/L的氫氧化鉀水溶液中，滲析2 3天，在_8 -15。C溫度 下凍干，得到殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料；3)葉酸-殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料探針的制備 將上述2)制備的殼聚寡糖-樹枝狀有機(jī)熒光染料的干品與葉酸按摩爾 比為1: 1溶解于二甲基亞砜溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)10小時后加入乙 醚，產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過濾所得到的沉淀物用乙醚洗滌后于25 35。C下真空 干燥，即得葉酸-可殼寡糖-樹枝狀化熒光染料探針干品。
6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是所述熒光染料的簡式 為T0-C00H, CY:廠COOH。
全文摘要
本發(fā)明提供一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針，該生物探針結(jié)構(gòu)包括在一個殼聚寡糖分子上連接1至15個樹枝狀有機(jī)熒光染料分子，同時再與一個葉酸分子結(jié)合形成的探針。同時還提供一種樹枝狀有機(jī)熒光染料生物探針的制備方法。本發(fā)明的效果是該生物探針制備方法簡單，對變異細(xì)胞具有較好的標(biāo)記靶向性，為標(biāo)記變異細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究提供方便。在標(biāo)記過程中表現(xiàn)出明顯的熒光加合效應(yīng)，增加了生物探針和細(xì)胞的生物相容性，明顯提高了光穩(wěn)定性，增大了標(biāo)記的靈敏度。該生物探針對檢測物的毒性低，靈敏度高，使用量少。該生物探針具有光譜范圍廣、摩爾消光系數(shù)大、無熒光背景、兩資產(chǎn)率高。
文檔編號C09K11/06GK101659864SQ200910070180
公開日2010年3月3日 申請日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者蘭云泉, 張寶蓮, 谷迎春, 費(fèi)學(xué)寧 申請人:天津城市建設(shè)學(xué)院