專利名稱：用于飽和標記蛋白質的試劑和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及熒光染料，以及用于對復合蛋白質樣品進行標記的方法，以實現(xiàn)差異蛋白分析。
雙向差異凝膠電泳(DIGE)在雙向(2D)電泳分離之前使用匹配的、可光譜分辨的熒光染料來標記蛋白質樣品(Minden，J.等人，Electrophoresis，(1997)，18，2071)。這種熒光多路復用技術克服了傳統(tǒng)的雙向電泳的很多缺點。對蛋白質樣品進行熒光預標記可以允許多個樣品在同一凝膠上操作，從而保證通過重疊熒光圖象可以方便地識別出這些樣品之間的定量差異。為了允許熒光多元化，必須用染料對蛋白質樣品進行相同的標記，并且被標記的蛋白質在凝膠中的遷移必須在位置上相匹配，以保證定量差異被檢測到。
WO 96/33406(Minden，J.等人)公開了一種檢測不同的細胞樣品之間的差別的方法，它在雙向電泳之前使用匹配的、可光譜分辨的染料來標記樣品中的蛋白質。為了保證等同的遷移，所述染料在分子量和電荷上是匹配的。該方法使用了具有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯反應性基團的花青染料來標記胺類。該NHS酯基靶向蛋白質中的賴氨酸殘基的ε-氨基，從而導致共價標記。將三種不同的染料(Cy2TM、Cy3和Cy5)衍生來實現(xiàn)多路傳輸。這些染料分子具有大約500道爾頓的分子量，并且為了保證被標記的蛋白質等同遷移，它們在質量上是匹配的。這類染料利用花青氟的本征電荷來彌補染料與賴氨酸軛合時賴氨酸的正電荷損失。WO 96/33406描述了這些染料在最小化標記策略中的應用，以便在1-2％的可附著位點之間進行標記。為了實現(xiàn)等同遷移，通過調節(jié)通過兩個碳單元與吲哚氮相連的脂肪鏈的大小，來彌補花青吲哚環(huán)之間的連接鏈長度上的差別，使這些染料對在質量上匹配。滿足這些標準的兩種或多種可光譜分辨的染料代表了匹配的最小化標記染料組。使用丙基Cy3和甲基Cy5標記蛋白質，然后雙向分離并將所得到的圖象重疊，表明這兩種被標記樣品在位置上是匹配的，從而證實了該匹配賴氨酸最小化標記染料組是等同遷移的。
賴氨酸殘基在蛋白質中是非常豐富的，這確保了這種標記策略代表在復合樣品中存在的所有蛋白質。然而，蛋白質中通常的賴氨酸含量為7％，并且如果蛋白質中的所有賴氨酸均被標記的話，可能引起因染料導致的大的質量變化。因此，所使用的策略對蛋白質進行“最小化”標記以確保5個蛋白質分子中僅有～1個被標記，從而保證所得到的統(tǒng)計概率為每個被標記的分子僅連接了一種染料。這樣得到十分類似于銀染圖象(silver stained image)的雙向斑點圖案，但是其賦予了更大的多路復用的靈敏度和動力學范圍以及能力。
典型的雙向凝膠分析包括從凝膠上“采集”感興趣的蛋白質斑點以通過MALDI-MS進行識別。最小化標記方法中每個蛋白質得到2個斑點(即被標記的和未被標記的)，其中大多數(shù)蛋白質是未被標記的斑點。未被標記的斑點必須被定位以回收足夠多的蛋白質從而確保證通過MALDI-MS進行鑒定。這要求在斑點采集之前進行附加的著色步驟。為了加快直接從熒光凝膠上采集蛋白質斑點，需要一種能使每種蛋白質得到單一斑點的標記策略。
為了標記盡可能多的目標殘基以及為了使每種蛋白質異形體得到單一被標記的斑點，本發(fā)明所使用的標記策略目的是將該蛋白質用染料飽和。因此，將花青染料分子偶合至蛋白質的所有可能利用的目標氨基酸殘基上，從而得到被標記蛋白質分子的單一種群，它們連接有數(shù)量相當?shù)娜玖戏肿?。根?jù)本發(fā)明，使用定向于含有巰基的半胱氨酸殘基的顏料組來實現(xiàn)飽和標記。半胱氨酸殘基存在于95％的蛋白質中，但是在每種蛋白質中半胱氨酸比賴氨酸少。這意味著所有的蛋白質分子都可以被標記，但是如果將賴氨酸殘基標記至飽和，那么每種蛋白質分子將具有更少的被標記殘基。這使得檢測的靈敏度得到提高，這是因為被標記蛋白質的比例高于使用最小化標記的比例，但是確保了這些蛋白保持可溶性。
與使用賴氨酸殘基的最小化標記策略相比，使用半胱氨酸殘基的飽和標記，由于加入了染料，質量增加更大(質量位移)。然而，如果對賴氨酸殘基使用飽和標記手段，那么觀察到的質量增加要小。因加入顏料而引起的質量位移的程度視各種蛋白質不同而不同，這取決于單個的蛋白質半胱氨酸的含量(通常是～2％)以及在標記條件下半胱氨酸殘基對染料的利用度。這導致雙向斑點圖案遠遠不同于先前已經(jīng)公開的銀染雙向蛋白質圖象。
因此，本發(fā)明提供了一類熒光試劑以及對存在于含半胱氨酸的蛋白質混合物中可接近的所有可能的半胱氨酸殘基進行重復標記的方法。根據(jù)本發(fā)明的花青染料衍生物提供了有用的熒光標記組，它們具有共同的核心結構并且尤其可用于多路復用分析。
因此，本發(fā)明第一方面提供了熒光染料的匹配組，它含有至少兩種式(I)結構的不同熒光染料 其中對于每一種所述染料，n不同，并且為1、2或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是下列基團 其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料是的兩種的n相差+1時，則所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1。
本發(fā)明提供了一種熒光染料的匹配組，其中該組中的每一種染料能夠共價連接于蛋白質上，并且其中每一種染料具有彼此互相匹配的分子結構和電荷，這樣使得使用該組中的一種染料標記的蛋白質的相對電泳淌度與用該組中另一種染料標記的蛋白質的相對電泳淌度相同或者基本上相同。在根據(jù)本發(fā)明第一方面的一個實施方案中，該染料匹配組含有至少兩種不同的熒光染料，其中所述組中的每一種染料為具有式(I)的化合物，其中Z1、Z2、R1、R2、R3、Y、W、n、p、q以及r如上文定義。適宜地，該熒光染料匹配組中的不同染料是光譜可分辨的以保證用這類染料標記的不同樣品彼此能夠互相區(qū)別開來。適宜地，該染料匹配組中的至少兩種染料具有根據(jù)式(I)的結構，它們可以選自三次甲基花青染料類(其中n＝1)、五次甲基花青染料類(其中n＝2)以及七次甲基花青染料(其中n＝3)。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的熒光染料匹配組含有至少兩種式(II)的不同熒光染料 其中對于每一種所述的染料，n不同，并且為1、2、或3；基團R1和R2中的一個是下列基團 其中Y是目標連接基團；
另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述的兩種染料的n相差+1時，所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1。
優(yōu)選地，該熒光染料匹配組含有至少兩種根據(jù)式(I)或(II)的不同染料，其中n選自1或2；p選自4或5；q選自2或3；以及r選自1、2或3。
優(yōu)選地，該熒光染料匹配組中的每一種染料的目標連接基團Y是相同的，并且選自馬來酰亞胺基(maleimido)和碘代乙酰胺基(iodoacetamido)。每種染料中特別優(yōu)選的目標連接基團是馬來酰亞胺基。
特別優(yōu)選的是選自三次甲基花青類染料和五次甲基花青類染料的式(I)或(II)的染料組。將這類染料描述為Cy3TM和Cy5染料。該花青染料的吸收和發(fā)射數(shù)據(jù)如下表1所示。
表1
適宜地，根據(jù)式(I)或(II)的熒光染料的鹽類選自K+、Na+、NH4+、R3NH+和R4N+，其中R是C1-C4烷基。
在一替代的實施方案中，該熒光染料匹配組可以任選地含有一種或多種附加的染料，條件是每一種所述的附加染料所具有的電荷和質量特性可以保證使用該染料標記的蛋白質的電泳淌度與使用根據(jù)式(I)或(II)的染料標記的蛋白質的電泳淌度相同或者基本上相同。其它的這類附加染料可以包括含有苯并噁唑的染料。附加染料的實例有Cy2。
含有成對的根據(jù)式(I)或(II)的、當其與蛋白質偶合時可獲得匹配的電泳淌度的熒光染料的示例性染料組合如下所述組11-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物II)；組21-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-丙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物III)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；組31-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物V)；組41-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VI)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[1(E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物VII)。
組合51-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VIII)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；以及組合61-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物IX)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-1(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物X)。
因此，本發(fā)明提供一種試劑匹配組，其在含半胱氨酸的蛋白質混合物中，在所使用的條件下，用于對所有可及半胱氨酸殘基進行重現(xiàn)性標記。為了使與染料連接的巰基上的中性電荷相匹配，利用整體上具有中性電荷的染料組可以在pl方向上獲得等同遷移。中性花青染料可以通過使磺酸或磺酸酯基取代基共價連接于染料結構上的方式獲得。此外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，等同的質量遷移并不是簡單地通過使染料組的分子量相匹配而獲得的，除此以外，為了使利用這類染料標記的蛋白質獲得位置上的匹配，還要求對染料的整體尺寸和質量進行細致的調節(jié)。為了利用半胱氨酸飽和標記方法獲得等同的遷移，要求染料組中的每一種根據(jù)式(I)的匹配染料在質量上相差一個碳單元。染料組可以通過改變連接于染料發(fā)色團上的不同取代基而得到。滿足上述要求的兩種或多種可光譜分辨的染料代表了匹配的飽和染料組。
本發(fā)明還提供了一種使用熒光染料飽和標記蛋白質的方法，它使得可以對蛋白質中所有可及的目標氨基酸殘基進行標記，從而得到被標記蛋白質分子的單一種群(single population)。適宜地，該目標氨基酸是半胱氨酸殘基。術語“可及的”是指可被熒光染料接近到以發(fā)生反應的氨基酸殘基?？杉暗陌腚装彼釟埢仨毷强山咏降?，并且必須是還原(即游離巰基)形式。
因此在第二個方面，本發(fā)明提供了一種用于對樣品中的蛋白質混合物進行標記的方法，其中每一種所述的蛋白質含有一種或多種半胱氨酸殘基，所述方法包括i)向含有所述樣品的含水液體中加入熒光染料，其中所述的染料含有與所述蛋白質共價反應的目標連接基團；然后ii)使所述染料與所述蛋白質發(fā)生反應以使所述染料對所述蛋白質進行標記；其特征在于，所述蛋白質中所有可能利用的半胱氨酸殘基被所述的染料標記。
優(yōu)選地，根據(jù)第二方面所述方法的熒光染料是花青染料。用于該方法中的特別優(yōu)選的花青染料是含有磺酸或磺酸酯基團的花青染料，例如根據(jù)式(I)的染料。
優(yōu)選地，該目標連接基團選自馬來酰亞胺基和碘代乙酰胺基。
在根據(jù)第二方面所述的優(yōu)選實施方案中，該方法在步驟i)之前還包括將所述蛋白質用還原劑處理。
優(yōu)選地，所述的花青染料在5-200nmol染料/50μg蛋白質的范圍內使用。
優(yōu)選地，根據(jù)第二個方面所述的用于對樣品中的蛋白質混合物進行標記的方法是在pH為6.0-9.0的范圍內進行的。
本發(fā)明還提供了一種使用根據(jù)式(I)的染料進行標記從而賦予樣品(適宜的是蛋白質樣品)熒光特性的方法。因此在第三個方面，本發(fā)明提供了一種對樣品中的一種或多種蛋白質進行標記的方法，該方法包括i)向含有所述一種或多種蛋白質的液體樣品中加入式(I)的熒光染料 其中對于每一種所述染料，n不同，并且為1、2、或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是下列基團 其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料中的兩種的n相差+1時，則所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1；然后在適合于對所述的一種或多種蛋白質進行標記的條件下，將所述的染料與所述的樣品一起孵育。
優(yōu)選地，Z1和Z2中的每一個表示閉合苯基環(huán)系所必需的碳原子。
優(yōu)選地，根據(jù)第三方面所述的方法使用式(I)的熒光染料，其中n選自1或2；p選自4或5；q選自2或3；以及r選自1、2或3。
優(yōu)選地，該目標連接基團Y選自馬來酰亞胺基和碘代乙酰胺基。
為了實現(xiàn)對蛋白質中半胱氨酸殘基進行飽和標記的方法，必須考慮諸多反應參數(shù)，包括i)蛋白質巰基的可接近性在天然折疊的蛋白質中，很多半胱氨酸殘基通過二硫鍵形成而與蛋白質的二級結構相關，并且它們還可能包埋在分子中心。為了標記這些殘基，必須使用蛋白質變性劑例如脲將蛋白質展開以保證能夠接近到所述染料，同時將其還原產(chǎn)生游離的巰基。還原劑的選擇對于實現(xiàn)蛋白質的有效還原是重要的。常用的含巰基蛋白質還原劑是二硫蘇糖醇(DTT)和β-巰基乙醇。適宜的膦還原劑包括三丁基膦(TBP)和三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。還可以使用硼氫化鈉。為了保證有效還原同時盡量最小化與染料的反應，TCEP是優(yōu)選的還原劑。
還原效率受還原劑的濃度(相對于蛋白質樣品中的半胱氨酸含量而言)、反應溫度(其對蛋白質變性產(chǎn)生影響)以及反應持續(xù)時間的影響。如果還原劑固定在珠上的話，這也可能會對效率產(chǎn)生影響。對于特定樣品類型而言，最佳的還原劑濃度將因所使用的還原劑和樣品中半胱氨酸含量的改變而改變。然而，還原50μg蛋白質通常需要10nmolTCEP(假設平均半胱氨酸含量為2％)。對于具有更高半胱氨酸含量的哺乳動物樣品而言，那么通常使用20nmol TCEP。另外為了獲得最佳標記，維持1nmol TCEP比2nmol染料的比例也是重要的。
對這些因素的最優(yōu)化組合因特定的蛋白質結構和半胱氨酸含量而變化。更高的還原溫度可以提高標記程度，這是因為提高了蛋白質變性程度從而使半胱氨酸的可接近性增加。然而，高溫對于蛋白質也具有負面作用。脲和氨基甲酸酯之間存在一個平衡，但是在高溫(通常是＞40℃)時這個平衡傾向于偏向氨基甲酸酯。氨基甲酸酯是比脲更具化學反應活性的物質，它可以攻擊伯胺(例如N-末端氨基和賴氨酸的ε-氨基)，導致人為的電荷異質以及在2D凝膠上產(chǎn)生電荷串。在37℃下、在脲存在下對半胱氨酸殘基進行飽和標記不會表現(xiàn)出氨基甲?；Ч?。
ii)染料濃度花青染料的疏水性，因而需要使用有機溶劑(例如10％的DMF)以幫助溶解。為了實現(xiàn)將所有可及的目標殘基飽和以完成標記，需要使用高濃度的染料進行標記，而同時仍然保持染料的溶解性。在花青染料上利用磺酸酯基團有助于保持高染料濃度下的溶解性。對于特定的樣品類型而言，標記反應中的最佳染料濃度取決于樣品中的半胱氨酸含量以及樣品中是否還存在可能對標記產(chǎn)生干擾的其它成分。然而，所述染料始終應該至少存在過量的巰基含量以實現(xiàn)飽和標記，同樣，為了實現(xiàn)最佳標記，保持1nmol TCEP比2nmol染料的比例也是很重要的。使用過量的染料通常是要求每50g蛋白質樣品中染料為5-200nmol。然而，為了完成標記反應通常是50μg蛋白質需要20nmol染料(假設平均半胱氨酸含量為2％)。對于具有更高半胱氨酸含量的哺乳動物樣品而言，通常是使用40nmol染料。當然，樣品中的其它成分也可能與染料反應。例如，肝樣品可能含有更高含量的三肽谷胱甘肽以對應激/毒性物質產(chǎn)生響應。因此，為了維持標記的有效性，可能需要提高染料的濃度。含有高水平白蛋白的血清樣品是一種具有高半胱氨酸含量的含量豐富的蛋白質，也可能需要較高的染料濃度。
iii)標記反應的pH半胱氨酸殘基是強的親核試劑，因而可以使用具有碘代乙酰胺和馬來酰亞胺反應活性基團的試劑將其標記在蛋白質中。特別優(yōu)選的反應活性基團是馬來酰亞胺基。在巰基反應活性的判斷中，其pKa顯得很重要。如果高于相應的pH，由于硫醇鹽(S-)形式取代了質子化的SH形式，從而導致其親和性顯著提高。在分離的半胱氨酸分子中，巰基的pKa大約為8.6；然而巰基在蛋白質中所處的微環(huán)境也可能影響其pKa。巰基與馬來酰亞胺的反應速度在堿性pH時有所增加，這是因為硫醇鹽陰離子的濃度增加了。在堿性條件下，馬來酰亞胺水解得到馬來酰胺酸成為重要的副反應，并且與其它功能基團例如賴氨酸和組氨酸的競爭反應變得更加明顯。
賴氨酸的ε-氨基相對于pKa為9.0-9.5的蛋白質中的典型胺。在較低的pH下例如pH6.5下，絕大多數(shù)胺基是以質子化了的、未反應的NH3+形式存在，與馬來酰亞胺基團的反應比與巰基的慢～1000倍。末端胺基具有7.5-8的pKa值為，取決于所對應的氨基酸。末端胺基在比賴氨酸更低的pH下可以以未質子化的(反應活性)形式存在。因此，馬來酰亞胺基團與胺的反應要求比與巰基反應更高的pH。這樣一來，使用馬來酰亞胺標記巰基在較低的pH下顯得更具特異性，它同時更不容易標記到賴氨酸殘基。因此，在實現(xiàn)飽和標記方面以及為了特異性的標記巰基，反應的pH也是一個重要因素。優(yōu)選使用例如根據(jù)式(I)的熒光染料的飽和標記是在pH為6.0-9.0的范圍內完成的，最優(yōu)選pH為8.0，這是存在反應活性硫醇鹽和存在反應活性胺之間的一個折衷。
用于比較的蛋白質樣品可來自于各種細胞源，包括由任意一種就物種(例如人類、嚙齒動物、猿)來說已知的細胞源、組織源(例如腦、肝、肺、心臟、腎、皮膚、肌肉)以及細胞類型(例如上皮細胞、內皮細胞)得到的所有正常和變異細胞。有各種已制定的協(xié)議可用于培養(yǎng)各種細胞類型(參見例如Freshney，R.I.，Culture of Animal CellsA Manual of Basic Technique，第二版，Alan R. Liss Inc. 1987)。本發(fā)明也可用于利用完整的植物或培養(yǎng)的植物細胞來比較植物樣品。此外，用于本發(fā)明方法中的樣品可以來自用重組基因轉染并培養(yǎng)過的細胞、經(jīng)受外界刺激(例如熱休克和藥物治療)或其它生物學流體(例如腦脊髓液或血清)處理過的細胞。本發(fā)明還可用于在標記之前定位存在于細胞中的蛋白質亞組；例如通過分離出特定部分例如低分子量蛋白質或pl范圍；亞細胞部分例如核內蛋白。
本領域技術人員應該理解，蛋白質樣品可以使用各種不同的方法和萃取試劑萃取由這類樣品得到。典型地，例如通過均化作用、超聲波降解、細胞裂解將來自組織/培養(yǎng)基的細胞分解，然后對所述的蛋白質在各種試劑存在下進行萃取或溶解，這些試劑包括變性試劑例如脲、硫脲，去污劑例如SDS、CHAPS、TritonX-100、NP-40，還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇以及緩沖劑例如Tris、Hepes。為了盡量減少被內生蛋白酶降解，還可以加入蛋白酶抑制劑例如苯甲磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽。
例如根據(jù)Minden，J.等人描述的方法(Electrophoresis，(1997)，18，2071)，本發(fā)明所述熒光染料組以及所述標記方法可用于檢測至少兩種不同的蛋白質樣品中蛋白質含量之間的差別。在該方法的典型實例中，將蛋白質從兩種不同樣品中按照上述已知方法萃取出來，然后測定蛋白質濃度。向每種蛋白質萃取液50μg等分液中加入10nmolTCEP(三-(2-羧基乙基)膦)，然后將其在37℃下孵育1小時。向每份所述還原后的蛋白質樣品中加入20nmol染料，然后在37℃下孵育30分鐘。將第一蛋白質樣品用染料匹配組中的第一染料(例如Cy3)標記，第二蛋白質樣品用染料匹配組中的第二染料(例如Cy5)標記。通過加入含有DTT的樣品緩沖液停止反應?；旌线@些被標記的蛋白質樣品，得到用于分離的單一樣品。該樣品可以通過電泳分離，優(yōu)選通過2D-PAGE分離。用于電泳分離的步驟是本領域技術人員眾所周知的。
在本發(fā)明的第四個方面，提供了一種試劑盒(kit)，所述的試劑盒包括含有至少兩種具有式(I)結構的不同熒光染料的熒光染料的匹配組 其中對于每一種所述的染料，n不同，并且為1、2、或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是下列基團
其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料中的兩種的n相差+1時，則所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1。
通過參照下面的實施例和附圖對本發(fā)明進行進一步描述，其中

圖1描述了使用半胱氨酸活性染料與2D電泳對蛋白質樣品進行差異分析的典型流程。兩種不同的蛋白質樣品是由細胞、組織或其它生物學流體制備得到的。第一和第二蛋白質樣品可以是任意的兩種樣品，其中理想的是將例如來自正常和患病組織、或者來自對照與藥物處理/刺激的細胞中的蛋白質的含量進行對比。該方法還可應用于單向分離系統(tǒng)。
圖2示出了使用染料組1、12和9進行標記、然后通過2D電泳分離的蛋白質的重疊圖象，標記的蛋白質斑點的輪廓用于證明位置匹配性。
實施例實施例1.染料的合成i)一般實驗步驟1H NMR(δH)光譜是在Jeol JNM-LA300 FT NMR分光光度計上記錄的?；瘜W位移以δ(ppm)為單位進行記錄。在適宜的氘化溶劑例如d4-甲醇中制備得到樣品溶液。UV/VIS光譜是使用Unicam UV3 UV/VIS光譜儀進行操作的。三甲氧基丙烯購自Karl Industries Inc.，Ohio，USA。其它所有的化學品購自Sigma-Aldrich Company Limited，Dorset，England。
N-BOC-氨基乙基馬來酰亞胺和N-BOC-氨基丙基馬來酰亞胺根據(jù)描述在J.Org.Chem.，(1995)，60，5352-5355中的文獻描述制備得到。
ii)2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀將肼苯磺酸(20.0g)溶解于乙酸(60ml)中，加入3-甲基-2-丁酮(26.0g)，然后加熱回流3小時。所得到的化合物通過在冰箱中刮涂冷卻而沉淀析出，所得到的白色漿狀物用丙-2-醇洗滌并過濾(71％)。
將2，3，3-三甲基-5-磺?；?假吲哚(16.45g)加熱溶解于甲醇(160ml)中，加入KOH在丙-2-醇(100ml)中的飽和溶液。溶液變成黃色，并形成固體。將溶液冷卻，過濾固體形成一灰白色固體(15.9g，98％)。δH(300MHz，CD3OD)7.84(m，2H)，7.46(d，1H)，3.30(s，3H)和1.35(s，6H)。
iii)1，2，3，3-四甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物將2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀(1.0g，3.61mmol)和碘代甲烷(0.25ml，3.97mmol)與二氯苯(10ml)在氮氣氣氛下混合。溶液在100℃下使用沙浴加熱4小時。開始形成固體，但是薄層色譜(30％MeOH/70％DCM)分析顯示產(chǎn)物并未完全形成，因此再加入等量的碘代甲烷，繼續(xù)加熱反應2小時，然后冷卻至室溫。通過過濾收集固體，用二氯苯、二乙基醚洗滌，然后真空干燥得到紫色固體(0.89g，98％)。δH(300MHz，CD3OD)8.06(m，1H)，7.94(dd，1H)，7.84(m，1H)，4.02(s，3H)和1.61(s，6H)。
iv)1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物將2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀(10.0g，41.97mmol)和碘代乙烷(4.0ml，50.35mmol)與二氯苯(40ml)在氮氣氣氛下混合。在120℃下使用沙浴加熱溶液16小時，得到紫色固體。通過過濾收集固體，然后用二氯苯、氯仿和乙醚洗滌得到淺粉紅色固體(10.2g，91％)。δH(300MHz，CD3OD)7.98(m，3H)，4.55(q，2H)，1.56(s，6H)和1.48(t，3H)。
v)1-丙基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物將2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀(1.0g，3.61mmol)和碘代丙烷(0.4ml，3.97mmol)與二氯苯(10ml)在氮氣氣氛下混合。將溶液在100℃下使用沙浴加熱20小時，得到紅棕色凝膠狀固體。通過過濾收集固體，用二氯苯、氯仿和二乙醚洗滌得到粉紅色固體(472mg，47％)。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，3H)，4.50(t，2H)，2.01(dt，2H)，1.56(s，6H)和1.13(t，3H)。
vi)1-磺丁基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物將2，3，3-三甲基假吲哚(2.0g，12.6mmol)和1，4-丁烷磺內酯(butanesultone)(1.7g，12.6mmol)混合在一起并在100℃加熱6小時。溶液逐漸轉紅，6小時后反應冷卻至室溫。將固體分散于二乙基醚中，過濾。收集固體并干燥。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，1H)，7.75(m，1H)，7.42(m，2H)，4.58(m，2H)，2.93(m，2H)，2.18(m，2H)，1.94(m，2H)和1.61(s，6H)。
vii)1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物將2，3，3-三甲基假吲哚(6.4g，40mmol)溶解于二氯苯(25ml)中攪拌直到溶液均勻。向其中加入6-溴己酸(15.6g，80mmol)，反應在沙浴中加熱至110℃，持續(xù)6.5小時。將反應冷卻至室溫，刮涂燒瓶側壁，然后將其置于冰箱中1小時。此后，在紫色溶液中形成淺褐色固體，通過過濾收集固體，然后用二氯苯和乙醚洗滌，得到淺褐色固體(7.42g，52％)。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，1H)，7.78(m，1H)，7.62(m，2H)，4.52(t，2H)，2.38(t，2H)，2.04(p，2H)，1.88-2.45(m，4H)和1.61(s，6H)。
viii)1-(4-羧基丁基)-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物將2，3，3-三甲基假吲哚(11.3g，40mmol)溶解于二氯苯(30ml)中攪拌直到溶液均勻。向其中加入5-溴丁酸(19.3g，106.6mmol)，反應在沙浴中加熱至110℃，持續(xù)6.5小時。將反應冷卻至室溫，刮涂燒瓶側壁，然后將其置于冰箱中1小時。此后，在紫色溶液中形成淺褐色固體，通過過濾收集固體，然后用二氯苯和乙醚洗滌，得到淺褐色固體(7.42g，52％)。δH(300MHz，CD3OD)7.90(m，1H)，7.78(m，1H)，7.62(m，2H)，4.59(t，2H)，2.41(t，2H)，2.04(m，2H)，1.76(m，2H)和1.61(s，6H)。
ix)氨基乙基馬來酰亞胺和氨基丙基馬來酰亞胺向4M鹽酸的二 烷溶液中加入適宜的BOC-氨基烷基馬來酰亞胺，反應在室溫下攪拌30分鐘。此時反應已經(jīng)沉淀析出固體，真空除去溶劑，得到白色絮狀固體。在下面的步驟中使用該化合物的粗產(chǎn)品。
x)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)將1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(2.0g，7.48mmol)、N，N′-二苯基甲脒(1.5g，7.48mmol)和原甲酸三乙酯(1.1g，7.48mmol)溶解于乙醇(10ml)中，然后回流(100℃)加熱3小時。在反應燒瓶側壁形成固體，UV/VIS示出408nm處有一新峰。加入二乙基醚，通過過濾收集沉淀和固體，用乙醚洗滌并真空干燥，得到黃色/橙色固體(1.83g，66％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝408nm。
向該Cy3半染料(1.83g，6.22mmol)的無水吡啶(10ml)溶液中加入乙酸酐(1.0ml)，反應在氮氣氣氛下攪拌10分鐘。然后加入1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(2.2g，6.22mmol)，反應在室溫下攪拌16小時。反應過程通過tlc檢測(20％ MeOH/80％DCM)。在減壓下除去溶劑，然后使用快速柱色譜法純化(反相二氧化硅∶水-50％甲醇梯度)得到299mg所需的Cy3酸產(chǎn)物(9％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。
在氮氣氣氛下，將Cy3酸(200mg，0.36mmol)溶解于無水DMF中，然后在室溫下攪拌。加入DIPEA(80μl，0.40mmol)和TSTU(120mg，0.40mmol)，反應攪拌2小時直到通過tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將該NHS酯用第二份等量的DIPEA(80μl，0.40mmol)處理，然后加入氨基乙基馬來酰亞胺(80mg，0.40mmol)，反應攪拌2小時。薄層層析法(Tlc)顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物，因此將反應用二乙基醚(50ml)稀釋，潷析溶劑，留下粉紅色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(98mg，34％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550mn。δH(300MHz，CD3OD)8.56(t，1H)，7.92(m，2H)，7.62-7.38(m，5H)，6.72(s，2H)，6.50(dd，2H)，4.19(m，4H)，3.52(m，2H)，2.15(t，2H)，1.94-1.56(m，6H)，1.75(s，12H)和1.44(t，3H)。
xi)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物II)將1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(5.00g，11.90mmol)懸浮于乙酸(40ml)和TFA(2ml，18.0mmol)的混合物中直到所有的固體全部溶解。向反應物中加入1，3，3-三甲氧基丙烯(12.5ml，95.0mmol)，然后在室溫下攪拌5小時。將溶液吸入500ml二乙基醚中，通過過濾收集所得到的沉淀(4.80g，含鹽)。
向該Cy5半染料(4.80g，14.9mmol)的甲醇(40ml)溶液中加入醋酸鉀(3.00g，34.2mmol)和1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(3.00g，16.4mmol)。攪拌過夜之后，將溶液吸入二乙基醚(500ml)中，通過過濾收集所得到的藍色固體并真空干燥。通過快速柱色譜法(反相二氧化硅∶水-50％甲醇梯度)純化，得到2.30g所需產(chǎn)物(28％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝642nm。
在氮氣氣氛下，將Cy5酸(200mg，0.36mmol)溶解于無水DMF中，然后在室溫下攪拌。加入DIPEA(80μl，0.40mmol)和TSTU(120mg，0.40mmol)，反應攪拌2小時直到通過tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將該NHS酯用第二份等量的DIPEA(80μl，0.40mmol)處理，然后加入氨乙基馬來酰亞胺(80mg，0.40mmol)，反應攪拌2小時。Tlc顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物，因此將反應用物二乙基醚(50ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下藍色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(105mg，43％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.18(dt，2H)，7.82(m，2H)，7.56-7.24(m，5H)，6.80(s，2H)，6.64(t，1H)，6.45(d，1H)，6.24(d，1H)，4.17(t，2H)，3.60(s，3H)，3.40(t，2H)，2.09(t，2H)，1.89-1.48(m，6H)和1.79(s，12H)。
xii)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-丙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物III)將1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓(6.0g，16.94mmol)和N，N′-二苯基甲脒(6.63g，33.87mmol)溶解于乙酸(20ml)中，然后回流(120℃)加熱4小時。使反應冷卻至室溫，真空除去溶劑。將所得到橙色油狀物溶解于氯仿中，用水洗滌，硫酸鎂干燥并濃縮為橙色油狀物的Cy3半染料。該油狀物直接使用不再純化。
向該Cy3半染料(1.00g，2.18mmol)的無水吡啶(1.0ml)溶液中加入乙酸酐(1.0ml)，反應在氮氣氣氛下攪拌10分鐘。然后加入1-丙基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物(0.92g，3.28mmol)，反應在室溫下攪拌16小時。通過tlc(20％MeOH/80％DCM)監(jiān)視反應進程。減壓下除去溶劑，利用快速柱色譜法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)純化得到241mg所需Cy3酸產(chǎn)物(21％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。
在氮氣氣氛下，將Cy3酸(100mg，0.18mmol)溶解于無水DMF中。加入DIPEA(30μl，0.20mmol)和TSTU(54mg，0.20mmol)，反應攪拌2小時直到通過tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(30μl，0.20mmol)處理，然后加入氨乙基馬來酰亞胺(40mg，0.20mmol)，反應攪拌2小時。Tlc顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物，因此將反應用二乙基醚(50ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下粉紅色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(41mg，34％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。δH(300MHz，CD3OD)8.52(t，1H)，7.90(m，2H)，7.60-7.39(m，5H)，6.78(s，2H)，6.52(dd，2H)，4.22(m，4H)，3.56(m，2H)，2.13(t，2H)，1.97-1.56(m，8H)，1.75(s，12H)和1.09(t，3H)。
xiii)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)將1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓(4.0g，14.59mmol)和丙二醛雙(苯基亞胺)鹽酸鹽(7.55g，29.18mmol)溶解于乙酸(20ml)中，然后回流(120℃)加熱4小時。反應冷卻至室溫，真空除去溶劑。將所得到的紅色油狀物溶解于氯仿中，用水洗滌，硫酸鎂干燥并濃縮為紅色油狀物的Cy5半染料。該油狀物直接使用不再純化。
向該Cy5半染料(1.00g，2.07mmol)的無水吡啶(10ml)溶液中加入乙酸酐(1.0ml)，反應在氮氣氣氛下攪拌10分鐘。向其中加入1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物(0.59g，2.28mmol)，反應在室溫下攪拌16小時。通過tlc(20％MeOH/80％DCM)監(jiān)視反應進程。減壓下除去溶劑，然后使用快速柱色譜法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)純化得到365mg所需的Cy5酸產(chǎn)物(31％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。
在氮氣氣氛下，將Cy5酸(52mg，0.09mmol)溶解于無水DMF中，并在室溫下攪拌。加入DIPEA(10μl，0.10mmol)和TSTU(28mg，0.10mmol)，反應攪拌2小時直到通過tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(10μl，0.10mmol)處理并加入氨乙基馬來酰亞胺(18mg，0.10mmol)，反應攪拌2小時。Tlc顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物，因此將反應用二乙基醚(30ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下藍色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(29mg，47％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.38(m，2H)，7.88(m，2H)，7.55-7.24(m，5H)，6.80(s，2H)，6.71(t，1H)，6.42(d，1H)，6.24(d，1H)，4.11(m，4H)，3.54(t，2H)，2.12(t，2H)，1.92-1.36(m，9H)和1.81(s，12H)。
xiv)1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3-H-吲哚鎓(化合物V)將1-(4-羧丁基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(2.00g，5.88mmol)和丙二醛雙(苯基亞胺)鹽酸鹽(2.28g，8.82mmol)溶解于乙酸(30ml)中，然后在120℃下加熱6小時。在真空除去乙酸之前使反應冷卻至室溫，得到粘性油狀物。將其溶解于氯仿中并用水洗滌，硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮得到更具粘性的油狀物。大部分未反應的丙二醛雙(苯基亞胺)殘余在氯仿/水的分界面上。所得到化合物使用快速柱色譜法(二氯甲烷-30％甲醇梯度)處理得到紅色固體(120mg，5％)。
向該Cy5半染料(120mg，0.31mmol)的無水吡啶(3ml)溶液中加入乙酸酐(0.5ml)，反應在氮氣氣氛下攪拌10分鐘。然后，加入1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚鎓碘化物(83mg，0.31mmol)，反應在室溫下攪拌過夜。減壓下除去溶劑，使用快速柱色譜法(二氧化硅∶二氯甲烷-40％甲醇梯度)純化得到84mg所需產(chǎn)物(48％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。
在氮氣氣氛下，將Cy5(84mg，0.15mmol)溶解于無水DMF溶液中，然后在室溫下攪拌。加入DIPEA(26μl，0.15mmol)和TSTU(45mg，0.15mmol)，攪拌反應2小時直到tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(DIPEA(26μl，0.15mmol))處理并加入氨乙基馬來酰亞胺(52mg，0.30mmol)，將反應再攪拌2小時。Tlc顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物，因此將反應用二乙基醚(50ml)稀釋，潷析溶劑，留下粉紅色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(30mg，30％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.15(q，2H)，7.80(m，2H)，7.52-7.31(m，5H)，6.75(s，2H)，6.64(t，1H)，6.46(d，1H)，6.32(d，1H)，4.27(m，4H)，4.15(t，2H)，2.09(t，2H)，1.79(s，6H)，1.65(s，6H)2.56-2.44(m，4H)和1.12(t，3H)。
xv)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VI)將1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(500mg，1.41mmol)、N，N′-二苯基甲脒(278mg，1.41mmol)以及1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(418mg，1.41mmol)溶解于無水吡啶(5ml)中，并在室溫下攪拌。然后加入乙酸酐(0.4ml)，反應在環(huán)境溫度下攪拌過夜。真空除去吡啶，所得到的紅紫色油狀物通過快速柱色譜法(二氯甲烷-10％甲醇梯度)純化得到粉紅色固體(67mg，8％)。
在氮氣氣氛下，將該Cy3酸(50mg，0.09mmol)溶解于無水DMF中，然后室溫攪拌。加入DIPEA(20μl，0.09mmol)和TSTU(59mg，0.18mmol)，反應攪拌2小時直到tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將該NHS酯用第二份等量的DIPEA(20μl，0.09mmol)處理，然后加入氨基乙基馬來酰亞胺(32mg，0.18mmol)，反應繼續(xù)攪拌2小時。反應用二乙基醚(50ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下粉紅色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(24mg，43％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。δH(300MHz，CD3OD)8.49(t，1H)，7.52-7.35(m，8H)，6.72(s，2H)，6.46(dd，2H)，4.09(m，4H)，3.57(m，2H)，2.85(m，2H)，2.15(t，2H)，1.94-1.43(m，10H)和1.85(s，12H)。
xvi)1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物VII)將1-(4-羧丁基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(1.0g，2.94mmol)和丙二醛雙苯基亞胺鹽酸鹽(760mg，2.94mmol)溶解于乙酸(10ml)中，然后在120℃下加熱18小時。在真空除去乙酸之前反應置冷，得到粘性紅色油狀物。將其溶解于氯仿中用水洗滌，硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮得到更具粘性的紅色/棕色油狀物。該化合物使用快速柱色譜法(二氯甲烷-20％甲醇梯度)純化得到橙色固體(1.43g，55％)。
向該Cy5半染料(120mg，0.26mmol)的無水吡啶(5ml)溶液中加入乙酸酐(0.5ml)，反應在氮氣氣氛下攪拌10分鐘。然后加入1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(83mg，0.28mmol)，反應在室溫下攪拌2小時。件壓下除去溶劑，使用快速柱色譜法(二氧化硅∶二氯甲烷-20％甲醇梯度)純化得到78mg所需產(chǎn)物(51％)。
在氮氣氣氛下，將該Cy5酸(50mg，0.09mmol)溶解于無水DMF中，室溫攪拌。加入DIPEA(15μl，0.10mmol)和TSTU(28mg，0.10mmol)，反應攪拌2小時直到tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(15μl，0.10mmol)處理并加入氨基乙基馬來酰亞胺(30mg，0.17mmol)，反應繼續(xù)攪拌2小時。Tlc分析顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物。反應用二乙基醚(50ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下藍色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(30mg，30％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.19(t，2H)，7.52-7.42(m，8H)，6.71(s，2H)，6.64(t，1H)，6.36(dt，2H)，4.18(m，4H)，3.55(m，2H)，2.89(m，2H)，2.15(t，2H)，1.79(s，12H)和2.01-1.36(t，8H)。
xvii)1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VIII)將1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(354mg，1.00mmol)、N，N′-二苯基甲脒(196mg，1.00mmol)以及1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物(267mg，1.00mol)溶解于無水吡啶(15ml)中，室溫攪拌。然后加入乙酸酐(0.5ml)，反應在環(huán)境溫度下攪拌過夜。真空除去吡啶，所得到的紅紫色油狀物通過快速柱色譜法(二氯甲烷-40％甲醇梯度)純化得到粉紅色固體(30mg，6％)。
在氮氣氣氛下，將該Cy3酸(30mg，0.05mmol)溶解于無水DMF中，然后室溫攪拌。加入DIPEA(10μl，0.05mmol)和TSTU(2mg，0.05mmol)，反應攪拌2小時直到tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(10μl，0.05mmol)處理，然后加入氨乙基馬來酰亞胺(9mg，0.05mmol)，反應繼續(xù)攪拌2小時。反應用二乙基醚(20ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下粉紅色殘余物。快速柱色譜法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(15mg，44％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝550nm。δH(300MHz，CD3OD)8.53(t，1H)，7.95(m，2H)，7.59-7.41(m，5H)，6.78(s，2H)，6.50(t，2H)，4.17(m，4H)，3.50(m，2H)，3.14(t，2H)，2.14(t，2H)，1.98-1.28(m，11H)和1.79(s，12H)。
xviii)1-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物IX)將1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(6.0g，16.95mmol)和N，N′-二苯基甲脒(6.63g，33.87mmol)溶解于乙酸(20ml)中，然后在120℃下加熱5小時。真空除去乙酸，殘余物使用柱色譜法(二氧化硅∶二氯甲烷-20％甲醇梯度)純化得到黃色/橙色固體(1.34g，21％)。
向該Cy3半染料(250mg，0.55mmol)的無水吡啶(5ml)溶液中加入乙酸酐(0.5ml)，反應在氮氣氣氛下攪拌10分鐘。然后加入1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(161mg，0.55mmol)，反應在室溫下攪拌22小時。減壓下除去溶劑，快速柱色譜法(二氧化硅∶二氯甲烷-20％甲醇梯度)純化得到142mg所需的Cy3酸產(chǎn)物(45％)。
在氮氣氣氛下，將Cy3酸(50mg，0.09mmol)溶解于無水DMF中，然后在室溫下攪拌。加入DIPEA(15μl，0.10mmol)和TSTU(28mg，0.10mmol)，反應攪拌2小時直到通過tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(15μl，0.10mmol)處理，同時加入氨丙基馬來酰亞胺(18mg，0.10mol)，反應攪拌2小時。反應用二乙基醚(50ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下粉紅色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(15mg，24％)。δH(300MHz，CD3OD)8.49(t，1H)，7.78-7.22(m，8H)，6.72(s，2H)，6.50(t，2H)，4.12(m，4H)，3.47(m，2H)，3.10(m，2H)，2.85(m，2H)，2.15(t，2H)，2.01-1.24(m，12H)和1.85(s，12H)。
xix)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物X)將1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物(353mg，1.00mmol)、丙二醛雙苯基亞胺鹽酸鹽(259mg，1.00mmol)和1-磺基丁基-2，3，3-三甲基吲哚鎓碘化物(295mg，1.00mmol)溶解于無水吡啶(5ml)中，室溫攪拌。然后加入乙酸酐(0.4ml)，反應在環(huán)境溫度下攪拌。真空除去吡啶，所得到藍色油狀物，通過快速柱色譜法(二氯甲烷-10％甲醇梯度)純化得到藍色固體(54mg，8％)。
在氮氣氣氛下，將該Cy5酸(49mg，0.08mmol)溶解于無水DMF中，然后在室溫下攪拌。加入DIPEA(12μl，0.09mmol)和TSTU(27mg，0.09mmol)，反應攪拌2小時直到通過tlc(20％MeOH/80％DCM)顯示NHS酯已經(jīng)完全形成。將所得到的NHS酯用第二份等量的DIPEA(12μl，0.09mmol)處理，然后加入氨基乙基馬來酰亞胺(28mg，0.16mmol)，反應繼續(xù)攪拌2小時。Tlc顯示已經(jīng)轉化為新產(chǎn)物，因此將反應物用二乙基醚(50ml)稀釋，輕輕傾出溶劑留下粉紅色殘余物?？焖僦V法(二氧化硅∶DCM-40％甲醇梯度)處理得到所需的馬來酰亞胺產(chǎn)物(24mg，45％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝644nm。δH(300MHz，CD3OD)8.21(t，2H)，7.54-7.26(m，8H)，6.80(s，2H)，6.64(t，1H)，6.38(dd，2H)，4.18(m，4H)，3.58(m，2H)，2.89(m，2H)，2.15(t，2H)，1.76(s，12H)和2.06-1.39(m，10H)。
xx)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物XI)按照類似的方法，將1，2，3，3-四甲基-5-磺?；?吲哚鎓碘化物和1-(5-羧戊基)-2，3，3-三甲基吲哚鎓溴化物與N，N′-二苯基甲脒一起反應形成Cy3酸，將其活化成N-羥基琥珀酰亞胺，再用氨乙基馬來酰亞胺處理，轉化為1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓。
實施例22.1蛋白質的分離和標記在E.coli樣品上進行初始試驗。將E.coli菌株ER 1647(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)在富含葡萄糖的MOPS介質中于37℃下培養(yǎng)過夜，然后在4℃、12,000×g下離心采集。將細胞丸顆用洗滌緩沖液(10mM Tris pH8.0，0.5mM醋酸鎂)洗滌。然后將細胞再次懸浮于溶菌緩沖液(8M脲，4％w/v CHAPS，40mM TrispH8.0)中，通過超聲波降解法(3×10秒脈沖，冰上)溶菌。E.coli溶菌液的蛋白質濃度使用Bio-Rad Dc蛋白質測定法按照制造商(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)所描述的方法進行測定。
在使用之前，將花青染料重構于無水DMF(Aldrich目錄編碼22，705-6)中使得最終濃度為10mM(10nmol/μl)。在加入DMF后將染料簡單進行渦旋以保證染料完全溶解。將該重構的染料儲存于-20℃下，在2周內使用。
通過加入10nmol TCEP[三-(2-羧基乙基)膦]，接著在37℃下孵育1小時，將50μg蛋白質的溶菌緩沖溶液中的二硫鍵還原。還原之后，加入20nmol重構的染料，在37℃下孵育30分鐘。使用等體積的2x樣品緩沖液(溶菌緩沖液和20mg/ml DTT以及4％(v/v)Pharmalytes 3-10)停止反應。在單向分離或避光長期冷凍保藏之前，將樣品簡單儲存在冰塊中。
2.2供分離的蛋白質樣品的制備用Cy3和Cy5標記等量的蛋白質樣品，化合物I-XI進行混合，得到如表2所示的染料配對組。
表2
2.3通過2D電泳分離蛋白質使用標準的Amersham Biosciences 2D PAGE裝置和PlusOneTM試劑(Buckinghamshire，UK)完成2-D電泳。將Immobiline DryStrips(pH3-10 NL或pH4-7 NL，24cm)在用2.5ml DryStrip涂液重疊的450μl復水緩沖液(8M脲，4％w/v CHAPS，1％Pharmalytes(pH3-10)，2mg/ml DTT)中、于Immobiline DryStrip Reselling Tray中再水化過夜。各試片(strip)使用多光子等電子聚集系統(tǒng)聚集。在雙向PAGE之前，各試片在鍍銀振動臺上用10ml平衡緩沖液A(8M脲，100mM Tris-HCl pH6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，5mg/ml DTT)平衡10分鐘，接著再用10ml平衡緩沖液B(8M脲，100mM Tris-HClpH6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，45mg/ml碘代乙酰胺)平衡10分鐘。裝入試片，在12％等度洗脫(isochratic)Laemmli SDS-PAGE凝膠上進行操作。
2.4熒光凝膠成像使用如下設置的2920 Masterlmager(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)觀察被標記的蛋白質
根據(jù)不同的試驗優(yōu)化曝光時間以在50,000圖象上得到最大的象素值從而避免信號飽和。將來自2D-Master的數(shù)據(jù)以TIF文件的形式輸入至Paintshop ProTM以生成彩色重疊圖象，供肉眼觀察。為了具體地定量分析染料的配對，將凝膠圖象輸入2D Image Master軟件程序中。
2.5圖象分析本研究中的凝膠分析是利用2D Image Master(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)——一種2-D分析軟件平臺完成的。在檢測到斑點之后，每個斑點的中心用于生成每個Cy3和Cy5圖象的象素坐標。通過對比這些Cy3和Cy5斑點中心的座標位置確定遷移匹配性的程度。它可以用于描述在x(pl)和y(質量)坐標上彼此相差±2象素的匹配斑點數(shù)目方面的位置配對。
由于兩種染料都被用來標記同樣的樣品，而在每種被標記樣品中存在相同的蛋白質，因此如果染料在等同遷移方面是匹配的，那么所有的斑點在兩張圖象之間就應該是精確重疊的。測量落入+/-2象素的斑點百分數(shù)以確定整體匹配性。
實施例3對于通過改變烷基鏈長度(r)在半胱氨酸殘基上進行的飽和標記來說匹配的染料的差異凝膠電泳通過使用每種染料對相同的復合蛋白質樣品(E.coli溶菌液)進行標記、混合這些Cy3和Cy5標記樣品，然后通過2D電泳分離，測試染料結構的作用。在熒光掃描之后，將圖象按照上面實施例所述的方法進行重疊和分析。
如上所述，將E.coli溶菌液用Cy3化合物和Cy5化合物標記。在分離之前，混合這些被標記樣品得到染料組合1、2、9、11和12，觀察通過增加CH2單元而改變烷基鏈長度所帶來的影響。表3示出了在對用染料組1、2、9、11和12標記的蛋白質重疊圖象進行分析之后得到的定量位置數(shù)據(jù)。
表3改變烷基鏈長度(r)對位置配對的影響
因此，當Cy3和Cy5具有相同的烷基鏈時(例如染料組11和12)，Cy3的總質量相對于Cy5而言有所降低。這導致質量方向上的位置配對較差。當烷基鏈長度存在兩個碳單元的差距時(例如染料組合9)，其質量配對有所改善。當各種染料之間存在單個碳原子的差距時(例如染料組1和2)，此時對于質量和pl而言獲得最佳的配對。優(yōu)選的染料組是染料組1。這表明，使用接頭r之間相差單個碳單元的遷移配對可以使被不同標記的蛋白質在2D電泳上獲得良好的位置配對。
圖2示出了使用染料組1、12和9進行標記、然后通過2D電泳分離的蛋白質的重疊圖象，標記蛋白質斑點的輪廓用于反映位置配對。該重疊圖象是由使用Cy3或Cy5標記的E.coli溶菌液的部分2D電泳凝膠得到的，它示出了～20-30kDa質量范圍和～5.5-6.0pl范圍。代表被Cy3和Cy5標記的蛋白質的蛋白斑點輪廓位置的圓圈(箭頭所指)是使用2D ImageMaster軟件測得的。染料組12得到較差的質量配對，這是因為被Cy5標記的蛋白質出現(xiàn)在被Cy3標記的蛋白質下方(實施例中箭頭所指)。染料組9也顯示出較差的質量配對，在該情形中被Cy5標記的蛋白質出現(xiàn)在被Cy3標記的蛋白質上方(實施例中箭頭所指)。優(yōu)選的染料組1得到最佳的位置配對。
實施例4對于通過改變吲哚核心之間的接頭長度(p)在半胱氨酸殘基上進行飽和標記而言匹配的染料的差異凝膠電泳如上所述，將E.coli溶菌液用Cy3和Cy5化合物標記，混合樣品得到染料組1和3。表4示出了在對使用這些染料組合標記的蛋白質重疊圖象進行分析之后得到的定量位置數(shù)據(jù)。
表4改變接頭長度(p)對位置配對的影響
這表明，使用接頭p之間相差單個碳單元的遷移匹配可以使被不同標記的蛋白質在2D電泳上獲得良好的位置配對。
實施例5對于通過改變馬來酰亞胺基團之間的接頭長度(q)在半胱氨酸殘基上進行飽和標記而言匹配的染料的差異凝膠電泳通過由氨基乙基到氨基丙基馬來酰亞胺使接頭長度增加單個的CH2單元，從而改變接頭q。如上所述，將E.coli溶菌液用Cy3和Cy5化合物標記，混合樣品得到染料組1、5和7。表5示出了在對使用這些染料組標記的蛋白質重疊圖象進行分析之后得到的定量的位置數(shù)據(jù)。
表5改變馬來酰亞胺接頭長度(q)對位置配對的影響
因此，可能是由于β-效應的原因，氨基乙基接頭(染料組合1)相對于氨基丙基接頭(染料組合5和7)而言具有更好的pl配對。當各種染料之間相差兩個碳單元時，質量配對也降低(染料組7)。當相差單個碳單元時，位置配對得到改善。因此，氨基乙基馬來酰亞胺接頭(q＝2)對于pl配對而言是優(yōu)選的。
實施例6對于通過改變磺酸酯基團的位置在半胱氨酸殘基上進行飽和標記而言匹配的染料的差異凝膠電泳磺酸酯化的花青染料通常具有直接連接于染料組1中的吲哚環(huán)的磺酸酯基團。通過將磺酸酯連接于通過丁基鏈接頭連接的環(huán)上，從而改變磺酸酯的位置。如上所述，將E.coli溶菌液用Cy3和Cy5化合物標記，混合樣品得到染料組1、4、6、8和10。表6示出了在對使用這些染料組標記的蛋白質重疊圖象進行分析之后得到的定量的位置數(shù)據(jù)。
表6改變磺酸酯位置對配對的影響
與前面的數(shù)據(jù)進行對比表明，將磺酸酯從環(huán)系上移到側鏈丁基鏈上似乎確實改變了pl匹配性。在質量方向上的配對并不比使用染料組1所獲得的配對好。在沒有對各種染料之間的n差異進行補償?shù)那樾蜗拢w移匹配對有所降低(染料組10)。如果存在兩個碳單元的差別(染料組8)，相對于染料組1而言其質量配對降低了。如果存在單個碳單元的差別(染料組4和6)，配對得到改善。最好的與側鏈丁基磺酸酯的組合將接頭9修飾成馬來酰亞胺(染料組6)。
權利要求
1.一種熒光染料的匹配組，它含有至少兩種式(I)結構的不同熒光染料 其中對于每一種所述的染料，n不同，并且為1、2、或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是下列基團 其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料中的兩種的n相差+1時，所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1。
2.一種熒光染料的匹配組，它含有至少兩種式(II)的不同熒光染料 其中對于每一種所述的染料，n不同，并且為1、2、或3；基團R1和R2中的一個下列是基團 其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料中的兩種的n相差+1時，所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1。
3.根據(jù)權利要求1或權利要求2的匹配組，它含有至少兩種不同的根據(jù)式(I)或(II)的熒光染料，其中n選自1或2；p選自4或5；q選自2或3；以及r選自1、2或3。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項的匹配組，其中該染料組中的每一種染料的目標連接基團Y是相同的，并且選自馬來酰亞胺基和碘代乙酰胺基。
5.根據(jù)權利要求4的匹配組，其中每一種染料中的Y是馬來酰亞胺基。
6.根據(jù)權利要求1-5中任意一項的匹配組，其中所述鹽類選自K+、Na+、NH4+、R3NH+和R4N+，其中R是C1-C4烷基。
7.根據(jù)權利要求1-6中任意一項的匹配組，它選自組11-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5 E)-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物II)；組21-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-丙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物III)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；組31-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物I)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物V)；組41-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VI)；和1-(5-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代戊基)-3，3-二甲基-2-[1(E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物VII)。組51-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[1E，3E)-3-(1-乙基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物VIII)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(1-乙基-3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物IV)；以及組61-(6-{[3-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(3，3-二甲基(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚鎓(化合物IX)；和1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E，5E)-5-(3，3-二甲基-1(1-磺基-丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚鎓(化合物X)。
8.一種用于對樣品中的蛋白質混合物進行標記的方法，其中每一種所述的蛋白質含有一種或多種半胱氨酸殘基，所述的方法包括i)向含有所述樣品的含水液體中加入熒光染料，其中所述的染料含有與所述的蛋白質共價反應的目標連接基團；然后ii)使所述的染料與所述的蛋白質發(fā)生反應以使所述的染料對所述的蛋白質進行標記；其特征在于，所述蛋白質中所有可利用的半胱氨酸殘基是用所述的染料進行標記的。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述的熒光染料是花青染料。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中所述的花青染料含有磺酸或磺酸酯基團。
11.根據(jù)權利要求8-10中任意一項的方法，其中所述的目標連接基團選自馬來酰亞胺基和碘代乙酰胺基。
12.根據(jù)權利要求8的方法，還包括在步驟i)之前將所述蛋白質用還原劑處理的步驟。
13.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述的染料在5-200nmol染料/50μg蛋白質的范圍內使用。
14.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述標記是在pH為6.0-9.0的范圍內進行的。
15.一種用于對樣品中的一種或多種蛋白質進行標記的方法，該方法包括i)向含有所述一種或多種蛋白質的液體樣品中加入式(I)的熒光染料 其中對于每一種所述染料，n不同，并且為1、2、或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是下列基團 其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料中的兩種的n相差+1時，所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1；然后ii)在適用于對所述的一種或多種蛋白質進行標記的條件下，將所述的染料與所述的樣品一起孵育。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其中Z1和Z2中的每一個表示閉合苯基環(huán)系所必需的碳原子。
17.根據(jù)權利要求15的方法，其中n選自1或2；p選自4或5；q選自2或3；以及r選自1、2或3。
18.根據(jù)權利要求15-17中任意一項的方法，其中所述的目標連接基團Y選自馬來酰亞胺基和碘代乙酰胺基。
19.一種試劑盒，它包括含有至少兩種具有式(I)結構的不同熒光染料的熒光染料匹配組 其中對于每一種所述染料，n不同，并且為1、2、或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是下列基團 其中Y是目標連接基團；另一個基團R1或R2選自-(CH2)4-W或-(CH2)r-H；基團R3是氫，除了當R1或R2是-(CH2)r-H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯；p是3-6的整數(shù)；q選自2或3；以及r是1-5的整數(shù)；以及它們的鹽類；其特征在于，當所述染料中的兩種的n相差+1時，所述的兩種染料的p、q和r中的一個相差-1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組匹配的熒光染料，其中該組中的每一種染料能夠共價連接于蛋白質上，并且其中每一種染料具有彼此互相匹配的分子結構和電荷，這使得利用該組中的一種染料標記的蛋白質的相對電泳淌度與用該組中另一種染料標記的蛋白質的相對電泳淌度相同。該匹配的組含有至少兩種不同的通式的熒光染料其中n是1、2或3；Z1和Z2獨立地表示閉合苯基或萘基環(huán)系所必需的碳原子；基團R1和R2中的一個是目標連接基團；其余的基團R1或R2選自－(CH2)4－W或－(CH2)r－H；基團R3是氫，除了當R1或R2是－(CH2)r－H時，R3是W的情形之外；W選自磺酸和磺酸酯。本發(fā)明還提供了一種使用熒光染料飽和標記蛋白質的方法，它使得可以對所有可得到利用的目標氨基酸、適宜的半胱氨酸、蛋白質中的殘基進行標記，從而得到被標記蛋白質分子的單一種群。
文檔編號C09B67/22GK1650168SQ02829498
公開日2005年8月3日 申請日期2002年7月8日 優(yōu)先權日2002年7月8日
發(fā)明者K·威廉斯, T·斯通, A·C·辛蒙茲, A·C·斯維特, S·J·福勒 申請人:阿默森生物科學英國有限公司