巖生忍冬總多糖提取物的制備方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種巖生忍冬總多糖的制備方法，以及由該方法得到的巖生忍冬總多糖提取物產(chǎn)品；同時，本發(fā)明還提供了該提取物用于制備預(yù)防和治療細(xì)菌性感染藥物的用途。本發(fā)明制備方法得到的巖生忍冬總多糖尤其適用于制備成獸用藥，用于牦牛和藏綿羊細(xì)菌性腹瀉等疾病的治療。
【專利說明】
巖生忍冬總多糖提取物的制備方法及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及藏獸藥巖生忍冬總多糖提取物及其提取工藝和用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 巖生忍冬（Lonicera rupicola Hook.f .et Thomson.)，又名西藏忍冬，為忍冬科 忍冬屬，是藤本藥用植物，主要產(chǎn)于寧夏、甘肅、青海東南部、四川西部、云南西北部及西藏 東部至西南部，生于高山灌叢草甸、流石灘邊緣、林緣河灘草地或山坡灌叢中，全植物均可 入藥。
[0003] 畜牧業(yè)是上述地區(qū)，尤其是四川省西北地區(qū)（川西北)甘孜、阿壩等地的主要農(nóng)業(yè) 形式之一。當(dāng)?shù)氐男笄莩Ｒ姴?、多發(fā)病、肆虐發(fā)病，如牦牛、藏綿羊細(xì)菌性腹瀉病和寄生蟲疾 病猖獗等，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)發(fā)展。
[0004] 川西北阿壩和甘孜兩州藏獸醫(yī)結(jié)合當(dāng)?shù)夭厮庂Y源優(yōu)勢選擇單方藥物或藥物組合 進(jìn)行防治具有一定經(jīng)驗，如原四川省汶川地區(qū)使用驗方(夏枯草、金銀花、菊花、千里光和荊 芥組方)治療牦牛結(jié)膜炎和角膜炎。
[0005] 金銀花和巖生忍冬均為忍冬屬植物，金銀花在川西北高原地區(qū)可用于畜禽常見疾 病的防治，而對巖生忍冬的利用卻沒有報道。中國藥典記載的金銀花（山銀花)主產(chǎn)于我國 北方、南方，西部地區(qū)使用金銀花在成本和來源上均受到一定的限制。而巖生忍冬主產(chǎn)于川 西北等西部地區(qū)，這些地區(qū)具有豐富的巖生忍冬植物資源。目前川西北牧區(qū)等對巖生忍冬 的開發(fā)和利用率都較低，如何有效發(fā)揮巖生忍冬的藥物活性、擴(kuò)展和升級治療用途和方式， 可為以巖生忍冬為代表的藏獸藥新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)，為川西北等畜牧業(yè)的健康、持續(xù)發(fā)展 保駕護(hù)航，并為藏獸藥的開發(fā)利用及產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的包括：
[0007] 提供一種巖生忍冬總多糖的提取工藝；
[0008] 提供一種巖生忍冬總多糖提取物產(chǎn)品；
[0009] 提供一種巖生忍冬總多糖提取物的用途。
[0010] 具體的，本發(fā)明提供了一種巖生忍冬總多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0011] (1)巖生忍冬粉碎；可過30-200目篩，如過40目、50目、80目、100目篩或40目、50目、 80目篩、100目藥典篩。
[0012] (2)取粉碎的巖生忍冬，按重量比計，以1: (20~40)的料液比加入水，于70~90°C 浸提1~3次，每次浸提時間45~75分鐘，合并浸提上清液，濃縮上清液，得巖生忍冬水提取；
[0013] (3)將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1-5次醇沉，優(yōu)選為3次。
[0014] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種巖生忍冬總多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0015] (1)巖生忍冬粉碎；如可粉碎至過40目、50目、80目、100目篩或40目、50目、80目篩 或100目藥典篩。
[0016] (2)取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，以重量比計，按1:40的料液比加入水，于90°C浸提 3次，每次浸提時間45分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70°C下濃縮；
[0017] (3)將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1-5次醇沉，優(yōu)選為3次。
[0018] 以及，進(jìn)一步的提供了一種巖生忍冬總多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0019] (1)巖生忍冬粉碎；可粉碎至過40目、50目、80目、100目篩或40目、50目、80目篩或 100目藥典篩。
[0020] (2)取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，以重量比計，按1:20的料液比加入水，于90°C浸提 2次，每次浸提時間60分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70°C下濃縮；
[0021] (3)將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1-5次醇沉，優(yōu)選為3次。
[0022] 以及，進(jìn)一步的提供了一種巖生忍冬總多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0023] (1)巖生忍冬粉碎；可粉碎至過40目、50目、80目、100目篩或40目、50目、80目篩或 100目藥典篩。
[0024] (2)取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，按1:20(重量比）料液比加入蒸餾水，于80°C浸提3 次，每次浸提時間75分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70 °C下濃縮；
[0025] (3)將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1-5次醇沉，優(yōu)選為3次。
[0026] 以及，進(jìn)一步的提供了一種巖生忍冬總多糖提取物的制備方法，包括以下步驟：
[0027] (1)巖生忍冬粉碎；可粉碎至過40目、50目、80目、100目篩或40目、50目、80目篩或 100目藥典篩。
[0028] (2)取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，按1:30(重量比）料液比加入蒸餾水，于90°C浸提1 次，每次浸提時間75分鐘，將上清液在70 °C下濃縮；
[0029] (3)將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1-5次醇沉，優(yōu)選為3次。
[0030] 上述制備方法所述的步驟(3)，優(yōu)選的醇沉方法為：
[0031] 取步驟(2)制備的濃縮物，于水中攪拌均勻，加入體積濃度為70~99 %的乙醇水溶 液，0~10°C放置5-24小時，離心，棄上清液；
[0032]向沉淀中加入體積濃度為60~90 %的乙醇水溶液，于水中攪拌均勻，離心，棄上清 液；
[0033]再向沉淀中加入無水乙醇，攪拌均勻，離心，棄上清液，得沉淀;沉淀可進(jìn)行干燥。
[0034] 進(jìn)一步的，步驟(3)所述醇沉為:取步驟(2)制備的巖生忍冬水提物，加入蒸餾水?dāng)?拌均勻后，加入95 %乙醇，4°C冰箱內(nèi)放置過夜;取放置過夜的待用液放入離心管中，離心后 棄去上清液，往沉淀中加入85%乙醇攪拌均勻離心，棄去上清液，沉淀加入95 %乙醇攪拌均 勻離心，棄去上清液，沉淀加入無水乙醇攪拌均勻，離心棄去上清液，取沉淀得總多糖;將總 多糖于60°C的烘干4個小時，得巖生忍冬總多糖提取物。
[0035] 此外，本發(fā)明還提供了一種巖生忍冬總多糖提取物；以及該巖生忍冬總多糖提取 物在制備預(yù)防和治療細(xì)菌性感染藥物中的用途，所述細(xì)菌如大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、普 通變形桿菌、肺炎克雷伯氏、痢疾志賀氏菌、中間耶爾森氏菌、糞腸球菌、屎腸球菌、阪崎腸 桿菌和/或陰溝腸桿;所述藥物優(yōu)選為獸藥;所述獸，優(yōu)選為牦牛、藏綿羊、藏雞，以及其他藏 區(qū)主要經(jīng)濟(jì)動物等。
[0036] 巖生忍冬可自行采集和炮制，采集后可將巖生忍冬切段3_5cm后置通風(fēng)處陰干;也 在藥材飲片市場購買得到。巖生忍冬為忍冬科忍冬屬植物巖生忍冬的全草。
[0037] 使用本發(fā)明可以達(dá)到以下有益效果:本發(fā)明充分利用了川西北等西部地區(qū)的植物 資源優(yōu)勢，為川西北常見藏藥材忍冬科忍冬屬植物巖生忍冬提供了有益的醫(yī)療用途，并篩 選出良好的提取制備工藝，以及尋找到巖生忍冬抑菌/抗菌活性最強(qiáng)的細(xì)菌類型，為川西北 禽畜常見病和多發(fā)病的防治提供了有益的選擇，并為后續(xù)以巖生忍冬為核心藥物，研制防 治牦牛細(xì)菌性腹瀉病等川西北禽畜疾病奠定良好基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 巖生忍冬采自四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣和若爾蓋縣，經(jīng)鑒定為忍冬科忍 冬屬植物巖生忍冬（Lonicera rupicola Hook.f.et Thomson·)。巖生忍冬也可在中藥材或 飲片市場購買得到。
[0039]實(shí)施例1巖生忍冬的水提工藝
[0040]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:20(重量比）料液比加入蒸餾水，于 70 °C浸提1次，每次浸提時間45分鐘，將上清液在70 °C下濃縮。
[0041]實(shí)施例2巖生忍冬的水提工藝
[0042]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:30(重量比）料液比加入蒸餾水，于 80 °C浸提2次，每次浸提時間45分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70 °C下濃縮。
[0043]實(shí)施例3巖生忍冬的水提工藝
[0044]將巖生忍冬粉碎，過篩;取巖生忍冬5g，按1:40 (重量比）料液比加入蒸餾水，于90 °C浸提3次，每次浸提時間45分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70°C下濃縮。
[0045]實(shí)施例4巖生忍冬的水提工藝
[0046]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:30(重量比）料液比加入蒸餾水，于 70 °C浸提3次，每次浸提時間60分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70 °C下濃縮。
[0047]實(shí)施例5巖生忍冬的水提工藝
[0048]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:40(重量比）料液比加入蒸餾水，于 80 °C浸提1次，每次浸提時間60分鐘，將上清液在70 °C下濃縮。
[0049]實(shí)施例6巖生忍冬的水提工藝
[0050]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:20(重量比）料液比加入蒸餾水，于 90°C浸提2次，每次浸提時間60分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70°C下濃縮。
[00511實(shí)施例7巖生忍冬的水提工藝
[0052]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:40 (重量比）料液比加入蒸餾水，于 70 °C浸提2次，每次浸提時間75分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70 °C下濃縮。
[0053]實(shí)施例8巖生忍冬的水提工藝
[0054]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:20(重量比）料液比加入蒸餾水，于 80 °C浸提3次，每次浸提時間75分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70 °C下濃縮。
[0055]實(shí)施例9巖生忍冬的水提工藝
[0056]將巖生忍冬粉碎，過篩;稱取巖生忍冬5g，按1:30(重量比）料液比加入蒸餾水，于 90 °C浸提1次，每次浸提時間75分鐘，將上清液在70 °C下濃縮。
[0057]實(shí)施例10醇沉工藝分離巖生忍冬水提物的總多糖(粗多糖）
[0058] 分別取實(shí)施例1-9制備得到的巖生忍冬水提物，冷卻后加入lOmL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?后，加入40mL 95 %乙醇，4°C冰箱內(nèi)放置過夜。取放置過夜的待用液放入離心管中，離心后 棄去上清液，往沉淀中加入85%乙醇攪拌均勻離心，棄去上清液，沉淀加入95 %乙醇攪拌均 勻離心，棄去上清液，沉淀加入無水乙醇攪拌均勻，離心棄去上清液，將裝有粗多糖的離心 管放入60 °C的鼓風(fēng)干燥箱中烘干4個小時，得巖生忍冬粗多糖提取物。由實(shí)施例1-9水提物 分離得到的巖生忍冬總多糖的干膏率見表1。
[0059] 由實(shí)施例1水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物1; 由實(shí)施例2水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物2;由實(shí)施例 3水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物3;由實(shí)施例4水提物 經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物4;由實(shí)施例5水提物經(jīng)醇沉分 離得到的巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物5;由實(shí)施例6水提物經(jīng)醇沉分離得到的 巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物6;由實(shí)施例7水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬 總多糖稱巖生忍冬總多糖提取物7;由實(shí)施例8水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖稱 巖生忍冬總多糖提取物8;由實(shí)施例9水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖稱巖生忍冬 總多糖提取物9;
[0060] 表1實(shí)施例1-9水提物經(jīng)醇沉分離得到的巖生忍冬總多糖的干膏率
[0061]
[0062]
[0063] 實(shí)施例11忍冬總多糖含量測定
[0064]含量測定方法：以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)蒽酮硫酸法測定巖生忍冬中糖的 總含量。稱取20mg干浸膏溶于lOOmL蒸餾水中，待用。取4支試管，編號1-4。1號加入0.4mL待 測溶液，不加蒸餾水。從1號管中取出〇.2mL加入2號管，用蒸餾水補(bǔ)足0.4mL，后面2-4號試管 按2號試管稀釋操作方法依次2倍倍比稀釋。然后向以上每個試管內(nèi)依次加入2mL蒽酮試劑， 沸水浴中準(zhǔn)確加熱lOmin，取出自來水浴中冷卻lOmin后，分光光度計測625nm處吸光值大 小，測吸光度值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出不同提取組合中巖生忍冬總糖含量，平行做3次重復(fù)。
[0065] 取實(shí)施例10制備的巖生忍冬總多糖1-9,按本實(shí)施例方法分別測定其忍冬總多糖 含量，含量測定結(jié)果見表2。
[0066] 表2巖生忍冬總多糖提取物的總多糖含量
[0067]
[0068]
[0069]實(shí)施例12巖生忍冬總多糖抑菌活性實(shí)驗
[0070] 采用微量稀釋法和紙片法評價巖生忍冬總多糖提取物對10種標(biāo)準(zhǔn)菌株的抗菌活 性。
[0071] ①巖生忍冬總多糖稀釋液的制備:取實(shí)施例6制備的巖生忍冬總多糖提取物，用去 離子水溶解均勻，過濾除菌后放置待用。
[0072] ②實(shí)驗菌株的選擇：14種標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國微生物所或中國獸藥監(jiān)察所，菌株包 括大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞桿菌CGMCCPa3、普通變形桿菌CGMCC1.491、肺炎克雷伯 氏菌CGMCC1.1062、痢疾志賀氏菌CGMCC1.1869、中間耶爾森氏菌CGMCC1.6197、糞腸球菌 ATCC25912、屎腸球菌ATCC35667、阪崎腸桿菌CGMCC1.6765、陰溝腸桿菌陰溝亞種CGMCC 1.2022。
[0073] ③微量稀釋法測定組方藥物抗菌效果
[0074] 實(shí)驗步驟及結(jié)果判定參考標(biāo)準(zhǔn)美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)推薦的微量 肉湯稀釋法操作程序進(jìn)行，具體操作步驟如下:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板1-12列各孔加 lOOyLMH肉 湯，然后分別在第1-3排的第1孔加入100yL巖生忍冬提取物，依次倍比稀釋至第11列，然后 第1-11列各孔加入l〇〇yL制備好的菌懸液。每個菌株在1個96孔板上進(jìn)行實(shí)驗。37°C培養(yǎng)16-24h后，計算MIC。實(shí)驗孔號及對應(yīng)濃度如下表3所示。
[0075] 表3實(shí)驗孔號中巖生忍冬總多糖提取物的實(shí)驗濃度表
[0076]
[0077] 試驗結(jié)果如表4所示:從表中可以看出，巖生忍冬總多糖對大多數(shù)實(shí)驗菌株表現(xiàn)出 不同程度的抗菌活性，其中巖生忍冬總多糖對普通變形桿菌C G M C C1.4 91、大腸桿菌 ATCC25922、痢疾志賀氏菌CGMCC1 . 1869、中間耶爾森氏菌CGMCC1.6197、阪崎腸桿菌 CGMCC1.6765和糞腸球菌ATCC25912的抗菌活性最強(qiáng)，對肺炎克雷伯氏菌CGMCC1.1062和銅 綠假單胞桿菌CGMCCPa3的抗菌活性居中，對腸沙門氏菌亞種CGMCC1.10754和陰溝腸桿菌陰 溝亞種CGMCC1.2022的抗菌活性較弱。
[0078] 表4巖生忍冬多糖提取物對10種菌株的體外抑菌效果
[0079]
[0080]
[0081 ] 注："+"表示孔內(nèi)有細(xì)菌生長，"_"表示孔內(nèi)無細(xì)菌生長。
【主權(quán)項】
1. 一種制備巖生忍冬總多糖提取物的方法，包括以下步驟： (1) 巖生忍冬粉碎； (2) 取粉碎的巖生忍冬，按重量比計，以1: (20~40)的料液比加入水，于70~90°C浸提1 ~3次，每次浸提時間45~75分鐘，合并浸提上清液，濃縮上清液，得巖生忍冬水提取； (3) 將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1 -5次醇沉，如3次。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 巖生忍冬粉碎； (2) 取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，按重量比計，以1:40的料液比加入水，于90°C浸提3次， 每次浸提時間45分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70°C下濃縮； (3) 將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1 -5次醇沉。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 巖生忍冬粉碎； (2) 取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，以重量比計，按1:20的料液比加入水，于90°C浸提2次， 每次浸提時間60分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70°C下濃縮； (3) 將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1 -5次醇沉。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 巖生忍冬粉碎； (2) 取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，按重量比計，以1:20料液比加入蒸餾水，于80°C浸提3 次，每次浸提時間75分鐘，將多次浸提的上清液合并，在70 °C下濃縮； (3) 將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1 -5次醇沉。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 巖生忍冬粉碎； (2) 取步驟（1)粉碎的巖生忍冬，按重量比計，以1:30料液比加入蒸餾水，于90°C浸提1 次，每次浸提時間75分鐘，將上清液在70 °C下濃縮； (3) 將步驟(2)得到的濃縮物進(jìn)行1 -5次醇沉。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的醇沉包括:取步驟 (2)制備的濃縮物，于水中攪拌均勻，加入體積濃度為70~99 %的乙醇水溶液，0~10 °C放置 5-24小時，離心，棄上清液； 向沉淀中加入體積濃度為60~90 %的乙醇水溶液，于水中攪拌均勻，離心，棄上清液； 再向沉淀中加入無水乙醇，攪拌均勻，離心，棄上清液，得沉淀;沉淀可進(jìn)行干燥。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述醇沉為:取步驟(2)制備的巖 生忍冬水提物，加入蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚝螅尤?5 %乙醇，4 °C冰箱內(nèi)放置過夜;取放置過夜的 待用液放入離心管中，離心后棄去上清液，往沉淀中加入85%乙醇攪拌均勻離心，棄去上清 液，沉淀加入95 %乙醇攪拌均勻離心，棄去上清液，沉淀加入無水乙醇攪拌均勻，離心棄去 上清液，取沉淀得總多糖;將總多糖于60 °C的烘干4個小時，得巖生忍冬總多糖提取物。8. 權(quán)利要求1-7任一項方法制備的巖生忍冬總多糖提取物。9. 權(quán)利要求8所述的巖生忍冬總多糖提取物在制備預(yù)防和治療細(xì)菌性感染藥物中的用 途，所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、普通變形桿菌、肺炎克雷伯氏、痢疾志賀氏 菌、中間耶爾森氏菌、糞腸球菌、屎腸球菌、阪崎腸桿菌和/或陰溝腸桿菌。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述藥物為獸藥;所述獸，優(yōu)選為牦牛、藏 綿羊、藏雞。
【文檔編號】C08B37/00GK106084084SQ201610536566
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】陳朝喜, 邱翔
【申請人】西南民族大學(xué)