一種忍冬藤提取物及其作為免疫增強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種忍冬藤提取物及其作為免疫增強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用。本發(fā)明制得的忍冬藤提取物在個(gè)體水平上，提高中華絨螯蟹成活率；在體液免疫方面，顯著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮濃度和抗菌肽基因的表達(dá)；在細(xì)胞免疫方面，提高血淋巴細(xì)胞總數(shù)，抑制凋亡基因的表達(dá)。本發(fā)明為防治中華絨螯蟹病菌侵害及提高免疫應(yīng)答水平提供一種純天然免疫增強(qiáng)劑，具有明顯的抗菌、抗病毒、無毒副作用、無污染、成本低、制備方法簡單的特點(diǎn)，拓寬了忍冬藤的應(yīng)用范圍。
【專利說明】一種忍冬藤提取物及其作為免疫増強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種忍冬藤提取物及其作為免疫增強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]中華絨鰲蟹(Er1cheir sinensis)，又名河蟹，是我國極為重要的特種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。自20世紀(jì)80年代以來，其養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，2007年全國成蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)48.95萬噸(2007中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)，產(chǎn)值達(dá)到300多億元，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著中華絨螯蟹人工養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，其病害日趨嚴(yán)重，尤其是細(xì)菌性與病毒性疾病的頻繁爆發(fā)，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失，嚴(yán)重制約了中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003]到目前為止，由病原生物引起的流行病已導(dǎo)致養(yǎng)殖業(yè)遭受重大經(jīng)濟(jì)損失。病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、寄生蟲一直在威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的安全。因此，尋找預(yù)防與治療的措施迫在眉睫。在傳統(tǒng)的疾病預(yù)防和治療過程中，化學(xué)藥物和抗生素被大規(guī)模施用，這些藥物的濫用帶來的環(huán)境危害，如破壞自然微生態(tài)系統(tǒng)，影響有機(jī)廢物的降解、抗藥病原生物的產(chǎn)生等，以及在生物體內(nèi)殘留對(duì)人類健康的潛在不良影響越來越受到人們的關(guān)注。因此，開發(fā)成本低、毒副作用低、不易產(chǎn)生抗藥性、作用效果顯著的免疫增強(qiáng)劑，提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫功能和機(jī)體免疫應(yīng)答能力，已經(jīng)成為免疫增強(qiáng)劑研宄領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種忍冬藤提取物，該提取物制備方法簡單，制備的產(chǎn)品殺菌、抗病毒作用強(qiáng)、無毒副作用、無污染、成本低。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供一種忍冬藤提取物作為免疫增強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用。以忍冬藤提取物作為免疫增強(qiáng)劑用于中華絨螯蟹的養(yǎng)殖，可顯著提高中華絨螯蟹免疫應(yīng)答能力。
[0006]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種忍冬藤提取物，其特征在于，它是由以下步驟制備得到:
(1)烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中進(jìn)行干燥，得到干燥的忍冬藤；
(2)提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以5_12倍量50%_95%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取1-3次，每次0.5-2 h，合并濾液；
(3)濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40-50 0C ；
(4)將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入冷凍室冷凍，然后在冷阱溫度為_45°C，真空狀態(tài)下干燥至粉末得粉末狀忍冬藤提取物。
[0007]上述步驟(I)中烘干溫度為90_95°C，時(shí)間為8-10小時(shí)。
[0008]上述步驟(2)中回流溫度為75°C。
[0009]上述步驟(4)中冷凍室溫度為-15°C ~_25°C，冷凍時(shí)間為4_6小時(shí)；冷凍干燥時(shí)間6-8小時(shí)，真空度為0.8Pa。
[0010]本發(fā)明還提供了一種忍冬藤提取物作為免疫增強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用。利用本發(fā)明的忍冬藤提取物作為免疫增強(qiáng)劑添加到養(yǎng)殖中華絨螯蟹所需的各種基礎(chǔ)飼料中，如白魚粉、田螺肉粉、花生餅粉、豆餅粉、甜玉米粉、骨粉、農(nóng)蝦肉粉等，制備成具有殺菌和抗病毒作用強(qiáng)、無毒副作用、無污染、成本低的養(yǎng)殖中華絨螯蟹的優(yōu)異飼料，其中復(fù)配飼料中忍冬藤提取物所占重量百分比為1%-3.0%。
[0011]本發(fā)明進(jìn)行了一系列免疫攻毒實(shí)驗(yàn)研宄。研宄結(jié)果表明:嗜水氣單胞菌感染后，在個(gè)體水平上，忍冬藤提取物能夠提高中華絨螯蟹成活率；在體液免疫方面，忍冬藤提取物能顯著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮濃度和抗菌肽基因的表達(dá)；在細(xì)胞免疫方面，忍冬藤提取物提高血淋巴細(xì)胞總數(shù)，抑制凋亡基因的表達(dá)。因此，忍冬藤提取物可通過調(diào)節(jié)中華絨螯蟹體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平來增強(qiáng)中華絨螯蟹的固有免疫應(yīng)答能力。
[0012]本發(fā)明的有益效果:在個(gè)體水平上，提高中華絨螯蟹成活率；在體液免疫方面，顯著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮濃度和抗菌肽基因的表達(dá)；在細(xì)胞免疫方面，提高血淋巴細(xì)胞總數(shù)，抑制凋亡基因的表達(dá)。本發(fā)明為防治中華絨螯蟹病菌侵害及提高免疫應(yīng)答水平提供一種純天然免疫增強(qiáng)劑，具有明顯的抗菌、抗病毒、無毒副作用、無污染、成本低、制備方法簡單的特點(diǎn)，拓寬了忍冬藤的應(yīng)用范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是LTE對(duì)中華絨螯蟹死亡率的影響結(jié)果；
圖2是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴溶菌酶活力的影響結(jié)果；
圖3是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力的影響結(jié)果；
圖4是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴一氧化氮濃度的影響結(jié)果；
圖5是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEd表達(dá)水平的影響結(jié)果；
圖6是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)的影響結(jié)果；
圖7是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中凋亡基因Caspase表達(dá)水平的影響結(jié)果；
圖8是LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中凋亡基因nm23表達(dá)水平的影響結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0015]實(shí)施例1
攻毒實(shí)驗(yàn)
對(duì)正常和嗜水氣單胞菌免疫刺激中華絨螯蟹體液免疫和細(xì)胞免疫影響的實(shí)驗(yàn)。
[0016]實(shí)驗(yàn)材料:
忍冬藤提取物；嗜水氣單胞菌(中國科學(xué)院海洋研宄所宋林生課題組);中華絨螯蟹250只，體重150±30 g，購買自山東省青島市南山水產(chǎn)批發(fā)市場，過濾海水適應(yīng)性暫養(yǎng)2周，溫度(18 土 2) V。
[0017]試劑:溶菌酶和一氧化氮試劑盒為南京建成生物工程研宄所產(chǎn)品；L-DOPA (3，4-二羥基苯丙氨酸)、磷酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、葡萄糖、二水合檸檬酸、檸檬酸三鈉為國藥產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TAKARA公司產(chǎn)品。
[0018]實(shí)驗(yàn)方法:
2.1忍冬藤提取物(LTE)的制備
(1)烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中于90-95°C干燥8-10小時(shí)，得到干燥的忍冬藤；
(2)提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以5_12倍量50%_95%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取2-3次，回流溫度75°C，每次1-2 h，合并濾液；
(3)濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40-50 0C ；
(4)將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入_15°C~_25°C冷凍室冷凍4-6小時(shí)，然后在冷阱溫度為_45°C，冷凍干燥6-8小時(shí)，真空度為0.8Pa，得粉末狀忍冬藤提取物。
[0019]2.2 LTE對(duì)中華絨螯蟹免疫應(yīng)答水平的影響
將中華絨螯蟹分為空白組、PBS組、嗜水氣單胞菌注射組(Ah組)、10MIC濃度處理組(LTE10)、100MIC濃度處理組(LTE100)，每組50只。其中，LTElO組和LTE100組提前24h注射不同濃度忍冬藤提取物。24h后，Ah組、LTElO組和LTE100組分別從中華絨螯蟹足間基膜處注射10(^1^嗜水氣單胞菌(5.0\10\扣/1^)。注射后，分別于他、311、611、1211、2411和48h隨機(jī)從各實(shí)驗(yàn)組取6只中華絨螯蟹進(jìn)行采樣。
[0020]制備血漿及RNA提取用血細(xì)胞，可用5 mL注射器抽取4°C預(yù)冷的抗凝劑(IL配方:NaCl 29.835 g，葡萄糖18 g，二水合檸檬酸38.426 g，檸檬酸三鈉8.823 g，EDTA.2Na3.7224 g，pH 7.3)，與從蟹的步足基關(guān)節(jié)膜處抽取的血淋巴以1:1比例混勻制成抗凝血。經(jīng)4 °C,SOOXg離心10 min，上清即為血漿，取出血漿后獲得血細(xì)胞沉淀，清洗后可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；提取RNA時(shí)可直接加Trizol吹打懸浮后_80°C冰箱中保存。
[0021]制備血清時(shí)，則用5 mL注射器直接從步足的基關(guān)節(jié)膜處抽取血淋巴，放入1.5 mLEppendorf管后于冰上靜置使其凝固，4 °C放置2-8 h后離心(10 min, 4 °C, 5000 rpm)，收集的上清液即為血清，于-20 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0022]2.3死亡率測定
分別于0h、3h、6h、12h、24h和48h測定各實(shí)驗(yàn)組死亡的中華絨螯蟹數(shù)目，統(tǒng)計(jì)死亡率的變化，并將死亡率的變化情況轉(zhuǎn)化成死亡率-時(shí)間曲線進(jìn)行分析。
[0023]2.4體液免疫指標(biāo)的測定
2.4.1溶菌酶活力測定
本研宄采用南京建成溶菌酶檢測試劑盒進(jìn)行溶菌酶活力的檢測。一般采用試劑盒提供的空白對(duì)照法進(jìn)行測定。
[0024]2.4.2血清酚氧化物酶(PO)活性測定
血清PO活性的測定以L-DOPA (3，4-二羥基苯丙氨酸)為底物，參照王雷等(1995)的方法加以改進(jìn)。在96孔板上依次加入:100 UL磷酸鉀鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.0，28°C)、50yL L-DOPA (3 mg/mL)*50yL血清，混勻后立即測定此體系490 nm下的初始吸光值，然后每隔2 min讀取一次吸光值，共讀取15次，即反應(yīng)周期為30min。酶活力以每分鐘0D490增加0.001為I個(gè)酶活力單位。
[0025]2.4.3 一氧化氮濃度測定本研宄使用南京建成生物有限公司的一氧化氮(NO)檢測試劑盒分析嗜水氣單胞菌感染前后，忍冬藤提取物對(duì)中華絨螯蟹血清中NO含量的影響。NO非常不穩(wěn)定，半衰期很短，僅2-5秒，其在細(xì)胞內(nèi)很快代謝為硝酸鹽等其他代謝產(chǎn)物。該試劑盒利用Griess法對(duì)硝酸鹽含量進(jìn)行檢測，進(jìn)而反映樣品中NO的含量。
[0026]2.4.4抗菌肽表達(dá)水平檢測
采用Real-time RT-PCR技術(shù)，在mRNA水平上檢測中華絨螯蟹抗菌肽CrusEs2在不同處理組中的表達(dá)規(guī)律。CrusEd的特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物為202 bp基因片段，內(nèi)參基因特異引物β-actin的RT-R擴(kuò)增產(chǎn)物為266 bp。
[0027]2.5細(xì)胞免疫指標(biāo)的測定
2.5.1血淋巴細(xì)胞密度測定
用胰蛋白酶消化細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，然后用70%乙醇固定30min，再用PBS洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用移液槍將500 μ L細(xì)胞懸液移至流式管中，加入5 μ LI mg/mLPI，輕輕吹打均勻后避光染色5~10min，放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0028]2.5.2血淋巴細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)檢測
采用Real-time RT-PCR技術(shù)，在mRNA水平上檢測中華絨螯蟹凋亡基因EsNm23和EsCaspase在不同處理組中的表達(dá)規(guī)律。EsNm23和EsCaspase的特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物分別為187 bp和157bp基因片段，內(nèi)參基因特異引物β-actin的RT-R擴(kuò)增產(chǎn)物為266 bp。
[0029]2.6統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X 土s )表示，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較用LSD法。結(jié)果以P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0030]結(jié)果
3.1 LTE對(duì)中華絨螯蟹死亡率的影響
嗜水氣單胞菌攻毒48 h后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹的死亡率為0，PBS對(duì)照組中華絨螯蟹的死亡率為3.3%，Ah組中華絨螯蟹死亡率為73.3%，LEElO組和LTE100組中華絨螯蟹的死亡率分別為26.7%和36.7%，見圖1o
[0031]3.2 LTE對(duì)中華絨螯蟹體液免疫的影響
3.2.1 LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴溶菌酶活力的影響
嗜水氣單胞菌攻毒后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴溶菌酶活力無變化，PBS對(duì)照組中華絨螯蟹溶菌酶活力變化不顯著(P >0.05)，Ah組中，注射嗜水氣單胞菌6 h和24 h后，中華絨螯蟹血淋巴溶菌酶活力分別顯著提高52.17% (P <0.05)和46.57% (P〈0.05)。與Ah組相比，注射嗜水氣單胞菌6 h后，LTElO和LTE100組中華絨螯蟹血淋巴溶菌酶活力分別提高 77.70% (P〈0.05)和 93.04% (P〈0.05)，結(jié)果見圖 2。
[0032]3.2.2 LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力的影響
從圖3結(jié)果可以看出，嗜水氣單胞菌攻毒后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力無變化，PBS對(duì)照組中華絨螯蟹酚氧化物酶活力變化不顯著(P >0.05)，Ah組中，注射嗜水氣單胞菌3 h，6 h和12 h后，中華絨螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力分別顯著提高
56.06% (P <0.05) ,48.19% (P〈0.05)和 37.00% (P〈0.05)。與 Ah 組相比，注射嗜水氣單胞菌3 h，6 h和12 h后，LTElO組中華絨螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力分別提高64.11% (P〈0.05)，55.12% (P <0.05)和40.78% (P <0.05) ;LET100組中華絨螯蟹血淋巴酚氧化物酶活力分別提高 92.08% (P <0.05), 86.14% (P〈0.05)和 33.33% (P〈0.05)。
[0033]3.2.3 LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴一氧化氮濃度的影響
從圖4結(jié)果中可以看出，嗜水氣單胞菌攻毒后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴一氧化氮濃度無變化，PBS對(duì)照組中華絨螯蟹一氧化氮濃度變化不顯著(P >0.05)，Ah組中，注射嗜水氣單胞菌24 h后，中華絨螯蟹血淋巴一氧化氮濃度顯著提高76.00% (P〈0.05)。與Ah組相比，注射嗜水氣單胞菌后，LTElO組中華絨螯蟹血淋巴一氧化氮濃度變化不顯著(P>0.05);注射嗜水氣單胞菌24 h后，LET100組中華絨螯蟹血淋巴一氧化氮濃度顯著提高27.08% (P <0.05) ο
[0034]3.2.4 LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因表達(dá)水平的影響
從圖5結(jié)果中可以看出，嗜水氣單胞菌攻毒后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEs2無變化，PBS對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEs2變化不顯著(P >0.05)，Ah組中，注射嗜水氣單胞菌3 h到48 h，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEs2表達(dá)水平顯著降低(P <0.05);在LTElO組中，注射嗜水氣單胞菌12 h后，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEs2的表達(dá)水平顯著低于PBS對(duì)照組，但是與Ah組相比，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEd表達(dá)水平變化無顯著差異；在LTE100組中，注射嗜水氣單胞菌3 h，6 h，12 h和48 h后，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞抗菌肽基因CrusEs2的表達(dá)水平顯著高于PBS對(duì)照組和Ah組(P〈0.05)。
[0035]3.3 LTE對(duì)中華絨螯蟹細(xì)胞免疫的影響
3.3.1 LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)的影響
從圖6結(jié)果中可以看出，嗜水氣單胞菌攻毒后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)無變化，PBS對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)變化不顯著(P >0.05)，Ah組中，注射嗜水氣單胞菌3 h和6 h后，中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)分別顯著降低27.42% (P〈0.05)和37.30% (P〈0.05)。與Ah組相比，注射嗜水氣單胞菌3h，6 h和12 h后，LTElO和LTE100組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總數(shù)顯著高于Ah組(P〈0.05)。
[0036]3.3.2 LTE對(duì)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平的影響
凋亡蛋白EsCaspase和EsNm23是細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。嗜水氣單胞菌攻毒后，空白對(duì)照組中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞凋亡基因EsCaspase和EsNm23的表達(dá)水平無變化，Ah組中，凋亡基因EsCaspase和EsNm23表達(dá)水平在注射嗜水氣單胞菌6 h和12 h后顯著提高。嗜水氣單胞菌感染后，EsCaspase基因在LTElO和LTE100組顯著低于Ah組表達(dá)水平(P〈0.05)(圖7)。EsNm23基因表達(dá)水平在LTElO中的表達(dá)水平顯著低于Ah組(P〈0.05)，在LTE100中的表達(dá)水平與Ah之間無顯著差異(P >0.05)(圖8)。
[0037]上述實(shí)驗(yàn)研宄結(jié)果表明:嗜水氣單胞菌感染后，在個(gè)體水平上，忍冬藤提取物能夠提高中華絨螯蟹成活率；在體液免疫方面，忍冬藤提取物能顯著提高其血淋巴血清中溶菌酶活力、酚氧化物酶活力、一氧化氮濃度和抗菌肽基因的表達(dá)；在細(xì)胞免疫方面，忍冬藤提取物提高血淋巴細(xì)胞總數(shù)，抑制凋亡基因的表達(dá)。因此，忍冬藤提取物可通過調(diào)節(jié)中華絨螯蟹體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平來增強(qiáng)中華絨螯蟹的固有免疫應(yīng)答能力。
[0038]實(shí)施例2
一種忍冬藤提取物，它是由以下步驟制備得到: (1)烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中進(jìn)行干燥，烘干溫度為90°C，時(shí)間10小時(shí)，得到干燥的忍冬藤；
(2)提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以5倍量95%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取3次，回流溫度75°C，每次I h，合并濾液；
(3)濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40-50 0C ；
(4)將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入-15°C冷凍室冷凍6小時(shí)，然后在冷阱溫度為_45°C，真空度為0.SPa下干燥8小時(shí)得粉末狀忍冬藤提取物。
[0039]本實(shí)施例制得的忍冬藤提取物在制備中華絨螯蟹養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用:復(fù)配飼料中各配方所占重量百分比為白魚粉40%、河蚌肉粉6%、花生仁餅粉15%、青魚粉10%、小海帶粉7 %、農(nóng)蝦肉粉5 %、甜玉米粉3 %、明膠7%、黃豆蛋白粉3 %、甘氨酸0.5%、粘合劑0.5%、忍冬藤提取物3%。按比例將上述物質(zhì)倒入粉碎機(jī)中粉碎，取出后放入攪拌機(jī)中攪拌280分鐘，然后用環(huán)模式硬顆粒機(jī)組生產(chǎn)成硬質(zhì)顆粒飼料，用40網(wǎng)目過篩，每粒重量為0.2克。
[0040]用本發(fā)明實(shí)施例制得的復(fù)配飼料采用常規(guī)喂養(yǎng)方法養(yǎng)殖中華鰲絨蟹，從幼仔養(yǎng)至成蟹，與未添加本發(fā)明忍冬藤提取物的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)相比，畝產(chǎn)率增加33.4%，病害發(fā)生率降低13.6%ο
[0041]實(shí)施例3
一種忍冬藤提取物，它是由以下步驟制備得到:
(1)烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中進(jìn)行干燥，烘干溫度為95°C，時(shí)間8小時(shí)，得到干燥的忍冬藤；
(2)提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以12倍量50%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取2次，回流溫度75°C，每次2h，合并濾液；
(3)濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40-50 0C ；
(4)將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入-25°C冷凍室冷凍4小時(shí)，然后在冷阱溫度為_45°C，真空度為0.SPa下干燥6小時(shí)得粉末狀忍冬藤提取物。
[0042]本實(shí)施例制得的忍冬藤提取物在制備中華絨螯蟹養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用:復(fù)配飼料中各配方所占重量百分比為白魚粉38%、田螺肉粉16%、花生餅粉10%、豆餅粉5%、甜玉米粉4 %、骨粉3 %，青魚粉6 %、農(nóng)蝦肉粉17 %、忍冬藤提取物I %。按比例將上述物質(zhì)倒入粉碎機(jī)中粉碎，取出后放入攪拌機(jī)中攪拌280分鐘，然后用環(huán)模式硬顆粒機(jī)組生產(chǎn)成硬質(zhì)顆粒飼料，用40網(wǎng)目過篩，每粒重量為0.2克。
[0043]用本發(fā)明實(shí)施例制得的復(fù)配飼料采用常規(guī)喂養(yǎng)方法養(yǎng)殖中華鰲絨蟹，從幼仔養(yǎng)至成蟹，與未添加本發(fā)明忍冬藤提取物的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)相比，畝產(chǎn)率增加34.5%，病害發(fā)生率降低11.8%ο
[0044]實(shí)施例4
一種忍冬藤提取物，它是由以下步驟制備得到:
(I)烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中進(jìn)行干燥，烘干溫度為94°C，時(shí)間9小時(shí)，得到干燥的忍冬藤； (2)提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以10倍量75%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取3次，回流溫度75°C，每次1.5h，合并濾液；
(3)濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40-50 0C ；
(4)將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入-20°C冷凍室冷凍5小時(shí)，然后在冷阱溫度為_45°C，真空度為0.SPa下干燥7小時(shí)得粉末狀忍冬藤提取物。
[0045]本實(shí)施例制得的忍冬藤提取物在制備中華絨螯蟹養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用:復(fù)配飼料中各配方所占重量百分比為白魚粉42 %、河蚌肉粉8 %、田螺肉粉9 %、花生仁餅粉8 %、小海帶粉7%、青魚粉7%、農(nóng)蝦肉粉6%、甜玉米粉4%、黃豆蛋白粉2 %、卵磷脂4.5%、粘合劑0.5%、膽固醇0.5%、忍冬藤提取物1.5%ο按比例將上述物質(zhì)倒入粉碎機(jī)中粉碎，取出后放入攪拌機(jī)中攪拌280分鐘，然后用環(huán)模式硬顆粒機(jī)組生產(chǎn)成硬質(zhì)顆粒飼料，用40網(wǎng)目過篩，每粒重量為0.2克。
[0046]用本發(fā)明實(shí)施例制得的復(fù)配飼料采用常規(guī)喂養(yǎng)方法養(yǎng)殖中華鰲絨蟹，從幼仔養(yǎng)至成蟹，與未添加本發(fā)明忍冬藤提取物的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)相比，畝產(chǎn)率增加35.2%，病害發(fā)生率降低12.6%ο
[0047]實(shí)施例5
一種忍冬藤提取物，它是由以下步驟制備得到:
(1)烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中進(jìn)行干燥，烘干溫度為92°C，時(shí)間9.5小時(shí)，得到干燥的忍冬藤；
(2)提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以8倍量80%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取2次，回流溫度75°C，每次lh，合并濾液；
(3)濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40-50 0C ；
(4 )將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入-2 O °C冷凍室冷凍4.5小時(shí)，然后在冷阱溫度為_45°C，真空度為0.SPa下干燥8小時(shí)得粉末狀忍冬藤提取物。
[0048]本實(shí)施例制得的忍冬藤提取物在制備中華絨螯蟹養(yǎng)殖飼料中的應(yīng)用:復(fù)配飼料中各配方所占重量百分比為白魚粉35 %、河蚌肉粉8 %、田螺肉粉7 %、花生仁餅粉8 %、小海帶粉12%、青魚粉7%、農(nóng)蝦肉粉10%、甜玉米粉4%、黃豆蛋白粉2 %、卵磷脂4%、粘合劑0.5%、膽固醇0.5%、忍冬藤提取物2%。按比例將上述物質(zhì)倒入粉碎機(jī)中粉碎，取出后放入攪拌機(jī)中攪拌280分鐘，然后用環(huán)模式硬顆粒機(jī)組生產(chǎn)成硬質(zhì)顆粒飼料，用40網(wǎng)目過篩，每粒重量為0.2克。
[0049]用本發(fā)明實(shí)施例制得的復(fù)配飼料采用常規(guī)喂養(yǎng)方法養(yǎng)殖中華鰲絨蟹，從幼仔養(yǎng)至成蟹，與未添加本發(fā)明忍冬藤提取物的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)相比，畝產(chǎn)率增加34.8%，病害發(fā)生率降低14.5%ο
【權(quán)利要求】
1.一種忍冬藤提取物，其特征在于，它是由以下步驟制備得到: 烘干:將忍冬藤清洗干凈后置于烘箱中進(jìn)行干燥，得到干燥的忍冬藤； 提取:將干燥的忍冬藤粉碎至3-5mm的小段，以5_12倍量50%_95%乙醇浸泡24小時(shí)后，水浴加熱回流提取2-3次，每次1-2 h，合并濾液； 濃縮:將合并濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至2-5ml，壓力為0.08MPa，溫度40_50°C ；將上述獲得的濃縮液進(jìn)行放入冷凍室冷凍，然后在冷阱溫度為-45°C，真空狀態(tài)下干燥至粉末得粉末狀忍冬藤提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的忍冬藤提取物，其特征在于，所述步驟(1)中烘干溫度為90-95°C，時(shí)間為8-10小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的忍冬藤提取物，其特征在于，所述步驟(2)中回流溫度為75。。。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的忍冬藤提取物，其特征在于，所述步驟(4)中冷凍室溫度為-15°C ~_25°C，冷凍時(shí)間為4-6小時(shí)；冷凍干燥時(shí)間6-8小時(shí)，真空度為0.8Pa。
5.一種權(quán)利要求1所述的忍冬藤提取物作為免疫增強(qiáng)劑在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK104473994SQ201410840096
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月30日
【發(fā)明者】史曉委, 張海娟, 許彥來, 王振, 石少英 申請(qǐng)人:臨沂大學(xué)