基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子及其在構(gòu)建納米材料中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子及其在構(gòu)建納米材料尤其是類彈性蛋白納米材料中的應(yīng)用，所述多肽單體分子由功能分子、聚合活性位點和類彈性蛋白重復(fù)多肽構(gòu)成，所述多肽單體分子可以高效地被谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化聚合，形成的聚合物具有溫敏特性，可以通過改變單體分子的多肽序列，調(diào)節(jié)聚合物的三維結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)化溫度、孔隙大小等參數(shù)；該聚合物可以在活細(xì)胞內(nèi)原位可控合成，并形成納米結(jié)構(gòu)；該納米材料的制備方法可以實現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)實時原位成像或高置留率的藥物遞送，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子及其在構(gòu)建納米材料 中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及納米材料制作技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽單體分子及其在構(gòu)建納米 材料中的應(yīng)用，尤其涉及一種基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子及其在構(gòu)建類彈性蛋 白納米材料中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 可控的納米材料制備是材料領(lǐng)域一貫的追求，這種可控不僅體現(xiàn)在納米尺度的均 勻度、表面化學(xué)性質(zhì)的統(tǒng)一性，也體現(xiàn)在制備方法的可控性。近年來，對于生物領(lǐng)域的應(yīng)用， 納米材料在體外的制備并具有生物功能已得到廣泛的發(fā)展，但是其中的生物安全性、材料 在復(fù)雜生理環(huán)境下的穩(wěn)定性以及納米材料的代謝等問題的突出也在一定程度上制約了納 米材料的發(fā)展。然而，針對上述問題提出的在活體或者活細(xì)胞內(nèi)原位組裝納米材料，并具有 生物功能的策略成為解決上述瓶頸問題的有效手段。該策略不僅體現(xiàn)了小分子在生物體內(nèi) 分布時的高效浸潤的優(yōu)勢，也體現(xiàn)了納米材料在病灶部位成像或治療的優(yōu)勢，成為時下最 具潛力的研究方向。
[0003] 在此體系中，多肽為基礎(chǔ)的組裝體系由于其生物相容性好、合成方法成熟等特點 成為首先的材料體系。在前期的研究基礎(chǔ)中，多肽的自組裝主要推動力為弱的作用力，例 如:氫鍵、范德華力、靜電相互作用、31-31相互作用等。其中在體外的多肽納米材料制備已經(jīng) 相當(dāng)成熟，部分材料已經(jīng)用于臨床研究。但是在活體內(nèi)原位的多肽納米材料組裝是近5年內(nèi) 才出現(xiàn)并發(fā)展的。典型的案例如Xu課題組利用細(xì)胞內(nèi)的磷酸酶使得入胞的多肽去磷酸化， 增強(qiáng)的疏水作用，導(dǎo)致在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了凝膠化的組裝，實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)酶的原位成像或者腫 瘤細(xì)胞的促凋亡作用。Rao課題組利用一種生物正交反應(yīng)，成功實現(xiàn)了多肽分子在細(xì)胞內(nèi)的 超分子組裝，可以用來監(jiān)控caspase-3酶的活性。也有研究在前期設(shè)計了葉綠素修飾的多肽 材料，通過明膠酶的分子剪切實現(xiàn)了在活體內(nèi)的納米纖維結(jié)構(gòu)的超分子組裝，成功用于活 體成像。
[0004] 雖然已有上述的成果案例，但是多肽在活體內(nèi)的超分子組裝仍然面臨著可控性 差、復(fù)雜環(huán)境下組裝效率不高等問題。因此，發(fā)展共價組裝體系將有效解決上述所面臨的困 難。結(jié)合生物體內(nèi)的內(nèi)源性催化劑-酶，建立共價酶催化聚合體系，將有效實現(xiàn)在復(fù)雜生理 環(huán)境下的可控聚合和分子組裝，將為納米材料的制備提供新思路和新方法，為生物領(lǐng)域的 應(yīng)用提供新技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種多肽單體分子及其在構(gòu)建納米 材料中的應(yīng)用，特別是提供了一種基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子及其在構(gòu)建類彈 性蛋白納米材料中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供了所述納米材料在細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量 成像或多肽緩釋藥物的遞送中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的多肽單體分子可以在細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化下發(fā)生聚合，形 成的聚肽具有類彈性蛋白性質(zhì)，可以在改變溫度的環(huán)境中發(fā)生聚合物鏈的扭曲和纏繞，實 現(xiàn)原位的納米超分子組裝以及可控地在細(xì)胞內(nèi)制備類彈性蛋白納米材料，并實現(xiàn)成像或者 疾病治療的功能。
[0007] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了一種基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，所述多肽 單體分子由功能分子、聚合活性位點和類彈性蛋白重復(fù)多肽構(gòu)成。
[0009] 本發(fā)明通過采用將多肽單體分子設(shè)計為由功能分子、聚合活性位點和類彈性蛋白 重復(fù)多肽構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，該分子設(shè)計方式不僅保證了聚合后的聚肽具有類彈性蛋白的性質(zhì)同 時也保證了所攜帶的功能分子的修飾密度。
[0010] 本發(fā)明中所述的多肽單體分子，其聚合活性位點是催化酶一谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的特 異性催化位點，包括谷氨酰胺(Q)端和賴氨酸(K)端，可以通過兩個活性端的催化偶聯(lián)實現(xiàn) 酶催化聚合。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明，所述多肽單體分子的具體結(jié)構(gòu)為:功能分子、聚合活性位點的谷氨酰 胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端，其依次連接構(gòu)成。將聚合活性位點 設(shè)計在類彈性蛋白重復(fù)多肽的兩端才可以實現(xiàn)酶催化聚合，同時保持聚合后的聚肽具有類 彈性蛋白的性質(zhì);兩端頭的聚合活性位點設(shè)計不可以改變。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，所述谷氨酰胺端序列表示為XQY，其表示具有3個氨基酸的多肽；其 中，X表示除脯氨酸以外的氨基酸，優(yōu)選為疏水性氨基酸;Q表示谷氨酰胺;Y表示除帶負(fù)電的 氨基酸以外的氨基酸，優(yōu)選為疏水性氨基酸。
[0013] 本發(fā)明所述的谷氨酰胺端序列中的X和Y可同時采用疏水性氨基酸，這樣的選擇可 以大大增加酶催化的選擇性和酶催化效率，對合成的聚合物的分子量有影響。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，所述谷氨酰胺端序列具體可以采用如SEQ ID N0.1-2之一所示的序 列，也可采用如下列舉的各序列:￥91?、￥91、￥〇￥、1^1、1^￥等，在此不做特別限定，需要強(qiáng)調(diào)的 是，本發(fā)明的谷氨酰胺端序列優(yōu)選采用如SEQ ID N0.1-2之一所示的序列，其在XQY的序列 中酶催化選擇性最高，催化得到的聚合物分子量最大。
[0015] SEQ ID N0.1：LQR
[0016] SEQ ID N0.2：RQL
[0017] 本發(fā)明通過采用具有上述具有通式XQY所示的谷氨酰胺序列，即采用將谷氨酰胺 設(shè)計成中間位置Q，在Q+1位置上設(shè)計為X氨基酸，在Q-1位置上設(shè)計為Y氨基酸，其優(yōu)勢在于 保持酶催化選擇性的同時，盡可能的減少對聚合后的類彈性蛋白聚肽的溫敏響應(yīng)性的影 響。因此三個氨基酸XQY的設(shè)計可以同時實現(xiàn)上述功能。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，所述類彈性蛋白重復(fù)多肽的序列中可以含有5-8個氨基酸，但并非僅 限于此；所述類彈性蛋白重復(fù)多肽的序列如SEQ ID N0.3-30之一所示，優(yōu)選為SEQ ID NO.24-30所示的序列，所述序列所形成的聚肽的類彈性蛋白性質(zhì)較好(靈敏的溫度響應(yīng)性、 轉(zhuǎn)折溫度可以在細(xì)胞培養(yǎng)的30-37Γ之間以及重復(fù)個數(shù)在20個重復(fù)單元以上就可以很好的 表現(xiàn)出類彈性蛋白的性質(zhì)）。
[0019] SEQ ID N0.3：GVGVP
[0020] SEQ ID N0.4：GVGHP
[0021] SEQ ID N0.5：GVGAP
[0022] SEQ ID N0.6：AVPGVG
[0023] SEQ ID N0.7：TVPGVG
[0024] SEQ ID N0.8：VAPGVG
[0025] SEQ ID N0.9：GVPGVG
[0026] SEQ ID N0.10：VHPGVG
[0027] SEQ ID N0.11：VPVGVG
[0028] SEQ ID N0.12：APVGVG
[0029] SEQ ID N0.13：VPAVG
[0030] SEQ ID N0.14：GPAVG
[0031] SEQ ID N0.15：TPAVG
[0032] SEQ ID N0.16：VPHVG
[0033] SEQ ID N0.17：GPHVG
[0034] SEQ ID N0.18：TPHVG
[0035] SEQ ID NO.19：RGDSPYQG
[0036] SEQ ID NO.20：RGDAPYQG
[0037] SEQ ID NO.21：RGDSPYG
[0038] SEQ ID N0.22：RGDSPFG
[0039] SEQ ID N0.23：RGDSPHG
[0040] SEQ ID N0.24：VPHVG
[0041] SEQ ID N0.25：GVGFP
[0042] SEQ ID N0.26：VHPGVG
[0043] SEQ ID NO.27：GRGDSPFG
[0044] SEQ ID N0.28：GRDGSPYG
[0045] SEQ ID N0.29：GRGESPYG
[0046] SEQ ID N0.30：GRGDSPYG
[0047] 根據(jù)本發(fā)明，所述功能分子為成像分子和/或藥物分子。
[0048] 優(yōu)選地，所述成像分子為焚光成像分子、光聲成像分子或極性敏感分子中的任意 一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為紫紅素18、焦脫鎂葉綠素、Cy5-Cy7或DBD分子中的任意一種 或至少兩種的組合。
[0049] 優(yōu)選地，所述藥物分子為腫瘤化療分子和/或抗生素分子，優(yōu)選為阿霉素和/或萬 古霉素。
[0050] 第二方面，本發(fā)明還提供了如第一方面所述的多肽單體分子的聚合方法，所述多 肽單體分子的聚合是在活細(xì)胞內(nèi)通過酶催化反應(yīng)聚合而成。
[0051] 本發(fā)明提供的多肽單體分子可以在活細(xì)胞內(nèi)通過酶催化反應(yīng)聚合而成，通過改變 聚合反應(yīng)的溫度，使得聚合物鏈發(fā)生扭曲或纏繞，從而實現(xiàn)納米超分子的原位組裝以及可 控地在細(xì)胞內(nèi)制備類彈性蛋白納米材料。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明，所述催化反應(yīng)的溫度為37-40 °C，例如可以是37°C、38°C、38.5°C、39 。(:或 40°C，優(yōu)選為 37°C。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，所述催化反應(yīng)的時間為4-12h，例如可以是4h、6h、7h、8h、1 Oh、1 lh或 12h，優(yōu)選為4h。本發(fā)明的催化反應(yīng)時間優(yōu)選為4h，其可以保證酶催化聚合后的聚肽分子量 的同時，盡可能減少反應(yīng)時間，也就是說催化4h時酶催化聚合速率達(dá)到平臺期。
[0054] 根據(jù)本發(fā)明，所述多肽單體分子的濃度為10-50μΜ，例如可以是10μΜ、20μΜ、25μΜ、 30μΜ、35μΜ、40μΜ 或 50μΜ，優(yōu)選為 50μΜ。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，所述酶的濃度為1-3U，例如可以是1U、1.2U、1.5U、1.8U、2U、2.5US 3U〇
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，所述酶與多肽單體分子的反應(yīng)摩爾比為1:5-1:10,酶與催化的多肽 底物比不同，對催化后的聚肽的分子量大小有影響。
[0057]根據(jù)本發(fā)明，所述酶為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
[0058]根據(jù)本發(fā)明，所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶包括細(xì)菌提取的重組蛋白、人或動物組織中提 取的TG2。
[0059]第三方面，本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合構(gòu)建納米材料的方法，包括以 下步驟：
[0060] (1)將如第一方面所述的多肽單體分子配制成溶液；
[0061] (2)將步驟(1)得到的多肽單體分子溶液加入到酶溶液中，在溫度為4-40Γ條件下 反應(yīng)4-12h，得到納米材料。
[0062] 本發(fā)明中得到的納米材料為類彈性蛋白納米材料。
[0063]根據(jù)本發(fā)明，步驟（1)所述多肽單體分子溶液采用HEPES緩沖溶液進(jìn)行配制;其中， 所述多肽單體分子溶液中多肽單體分子的濃度為1〇〇-1〇〇〇μΜ，例如可以是100μΜ、300μΜ、 50(^]?、60(^]\1、70(^]\1、80(^]\1或100(^]\1，優(yōu)選為60(^]\1。
[0064] 根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述反應(yīng)的溫度為37-40°C，例如可以是37 °C、38 °C、38.5 °C、 39°(：或40°(：，優(yōu)選為37°(：。
[0065] 根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述反應(yīng)的時間為4-12h，例如可以是4h、6h、7h、8h、10h、1 lh 或12h，優(yōu)選為4h。
[0066] 第四方面，本發(fā)明還提供了一種如第三方面所述的方法制備得到的納米材料，所 述納米材料為一維和/或三維納米結(jié)構(gòu)。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明，所述一維結(jié)構(gòu)的聚合單體兩端分別由谷氨酰胺(Q)端和賴氨酸(K)端 組成;所述三維結(jié)構(gòu)的聚合單體兩端分別由谷氨酰胺-賴氨酸(QK)端和賴氨酸-谷氨酰胺 (KQ)端組成。
[0068]根據(jù)本發(fā)明，所述谷氨酰胺端序列如SEQ ID N0.1-2之一所示;所述谷氨酰胺-賴 氨酸端序列如SEQ ID N0.31所示;所述賴氨酸-谷氨酰胺端序列如SEQ ID N0.32所示。
[0069] SEQ ID N0.31：RQLK
[0070] SEQ ID N0.32：KRQL
[0071] 第五方面，本發(fā)明還提供了如第四方面所述的納米材料的用途，所述納米材料可 以用于細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量成像或多肽緩釋藥物的遞送，其中所述藥物可用于抗 腫瘤或抗感染。
[0072] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：
[0073] 本發(fā)明提供的多肽單體分子可以在細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化下發(fā)生聚合，形 成的聚肽具有類彈性蛋白性質(zhì)，可以在改變溫度的環(huán)境中發(fā)生聚合物鏈的扭曲和纏繞，實 現(xiàn)原位的納米超分子組裝以及可控地在細(xì)胞內(nèi)制備類彈性蛋白納米材料，并實現(xiàn)成像或者 疾病治療的功能。
【附圖說明】
[0074] 圖1是本發(fā)明多肽單體分子的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0075] 圖2是本發(fā)明多肽單體分子在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生聚合反應(yīng)的示意圖；
[0076]圖3是實施例1中所述聚合單體分子的MALDI-T0F圖
[0077]圖4是實施例1中所述聚多肽在溶液內(nèi)組裝的納米結(jié)構(gòu)掃描電鏡；
[0078]圖5是實施例1中所述納米聚集體在細(xì)胞成像的應(yīng)用；
[0079]圖6是實施例2中所述納米凝膠的掃描電鏡；
[0080] 圖7是實施例2中所述納米凝膠對于細(xì)胞骨架的破壞，其中圖7(a)表示TG2陽性細(xì) 胞;圖7(b)表示TG2陰性細(xì)胞。
【具體實施方式】
[0081] 本發(fā)明中提供的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其是由功能分子、聚合 活性位點和類彈性蛋白重復(fù)多肽構(gòu)成，具體結(jié)構(gòu)為：功能分子、聚合活性位點的谷氨酰胺 端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接，其具體結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0082] 本發(fā)明中提供的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其在活細(xì)胞內(nèi)通過酶， 優(yōu)選通過谷氨酰胺酶催化反應(yīng)聚合，通過改變聚合反應(yīng)的溫度，使得聚合物鏈發(fā)生扭曲或 纏繞，從而實現(xiàn)納米超分子的原位組裝以及可控地在細(xì)胞內(nèi)制備類彈性蛋白納米材料，其 具體的聚合過程如圖2所示。
[0083] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，本發(fā)明所涉及的主題保護(hù)范圍并非僅限 于這些實施例。
[0084] 實施例1
[0085] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0086]其中，功能分子為DBD熒光信號分子；聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQ ID NO.2所示的序列RQL;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID NO.25所示的序列:GVGFP;聚合活 性位點的賴氨酸端為K( Lys )，該多肽單體分子的結(jié)構(gòu)如下所示。
[0087]
[0088] 實施例2
[0089] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0090] 其中，功能分子為DBD熒光信號分子；聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQ ID N0.1所示的序列LQR;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID勵.24所示的序列:￥?狀6;聚合活 性位點的賴氨酸端為K(Lys)。
[0091] 實施例3
[0092] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0093]其中，功能分子為DBD熒光信號分子；聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQ ID NO. 2所示的序列RQL;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID NO. 3所示的序列:GVGVP;聚合活 性位點的賴氨酸端為K(Lys)。
[0094] 實施例4
[0095] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0096]其中，功能分子為阿霉素;聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQ ID NO.1所示的 序列LQR;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID NO.27所示的序列:GRGDSPFG;聚合活性位點 的賴氨酸端為K(Lys)。
[0097] 實施例5
[0098] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0099]其中，功能分子為萬古霉素;聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQ ID N0.2所示 的序列RQL;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID NO. 29所示的序列:GRGESPYG;聚合活性位 點的賴氨酸端為K(Lys)。
[0100] 實施例6
[0101] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0102] 其中，功能分子為Cy5-Cy7;聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQ ID N0.1所示 的序列LQR;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID N0.29所示的序列:GRGESPYG;聚合活性位 點的賴氨酸端為K(Lys)。
[0103] 實施例7
[0104] 基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其結(jié)構(gòu)設(shè)計為:功能分子、聚合活性位點 的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù)多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接。
[0105] 其中，功能分子為Cy5-Cy7;聚合活性位點的谷氨酰胺端序列為SEQIDN0.2所示 的序列RQL;類彈性蛋白重復(fù)多肽序列為SEQ ID N0.30所示的序列:GRGDSPYG;聚合活性位 點的賴氨酸端為K(Lys)。
[0106] 實施例8
[0107] 實施例1中的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子的聚合方法，包括:在活細(xì)胞 內(nèi)通過谷氨酰胺酶在37 °C下，催化反應(yīng)4h聚合而成。
[0108] 實施例9
[0109] 實施例2中的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子的聚合方法，包括:在活細(xì)胞 內(nèi)通過谷氨酰胺酶在37 °C下，催化反應(yīng)6h聚合而成。
[0110] 實施例1〇
[0111] 實施例4中的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子的聚合方法，包括:在活細(xì)胞 內(nèi)通過谷氨酰胺酶在39 °C下，催化反應(yīng)12h聚合而成。
[0112] 實施例11
[0113] 實施例6中的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子的聚合方法，包括:在活細(xì)胞 內(nèi)通過谷氨酰胺酶在40°C下，催化反應(yīng)8h聚合而成。
[0m] 實施例12
[0115]利用實施例1的基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子制備納米材料的方法，包 括以下步驟：
[0116] (1)連接多肽的合成
[0117]采用Fmoc固相合成法合成連接多肽：
[0118]合成選用〇 . 35mM修飾密度的Wang樹脂，其中第一個氨基酸(賴氨酸）的N端被Fmoc 保護(hù)，C端固定于樹脂上。用20%(v/v)的六氫吡啶的DMF溶液脫去N端的Fmoc保護(hù)，然后用茚 三酮測試法測試脫保護(hù)結(jié)果。然后將下一個氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基嗎啉(NMM)和10 倍于氨基酸的苯并三氮唑-^『少'-四甲基脲六氟磷酸酯(耶1'1])的01^溶液活化，并加入 到脫去保護(hù)的樹脂中反應(yīng)2h。按此方法，將剩余的所有氨基酸都通過縮合反應(yīng)連接上去，形 成固定于樹脂的連接多肽。
[0119] (2)熒光信號分子DBD連接多肽的合成
[0120] 在步驟(1)完成所有氨基酸的合成后，將活化好的DBD熒光信號分子作為最后一個 氨基酸重復(fù)上述步驟偶聯(lián)在連接多肽的N端;然后用含有2.5%水和2.5%三異丙基硅烷的 三氟乙酸溶液將合成好的多肽從樹脂上脫除，同時脫除氨基酸的側(cè)鏈保護(hù);將三氟乙酸用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除，然后多肽的粗產(chǎn)物用無水乙醚沉淀，洗滌并干燥;最后選用反相制備液相 色譜，將多肽純化。
[0121] 純化過程的條件為:流動相是含有0.1%三氟乙酸的乙腈和含有0.1%三氟乙酸的 雙蒸水;參數(shù)是梯度洗脫從5%乙腈/95%水到60%乙腈/40%水，流速為10ml/min，處理時 間為30min。上述方法所得到的聚合單體分子的MALDI-T0F圖譜如圖3所示。
[0122] (3)多肽在酶催化下的聚合。
[0123] 將合成好的聚合單體分子用HEPES緩沖溶液溶解，加入到配制好的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移 酶溶液中，37°C，150rmp下?lián)u床4h左右，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶可以催化多肽鏈賴氨酸上氨基和谷 氨酰胺上羥酰胺基之間發(fā)生共價交聯(lián)，從而形成對熱敏感的類彈性蛋白聚肽，形成的聚合 物分子量約為30000,聚合度為27-28。該聚合物在體外的納米組裝形貌用掃描電鏡表征，如 圖4所示。
[0124] (4)該原位納米材料的組裝方法用于監(jiān)控谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0125] 將聚合單體分子以濃度為600μΜ的最終濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)12h 后，用PBS將細(xì)胞反復(fù)清洗三次，然后用Hochest (藍(lán)色)和Di 1 (紅色)分別對細(xì)胞核和細(xì)胞膜 進(jìn)行染色，并用熒光共聚焦顯微鏡成像，成像溫度為4°C(如圖5所示）。
[0126] 實施例13
[0127] 利用基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子制備納米材料的方法，包括以下步 驟：
[0128] 以SEQ ID ^).24所示的序列￥?狀6為彈性蛋白多肽片段，6111-1^8和1^8-6111分別 為Q端和K端，分子序列為QKVPHVGQK，按如下步驟進(jìn)行本發(fā)明類彈性蛋白納米凝膠的合成：
[0129] (1)連接多肽的合成
[0130]采用Fmoc固相合成法合成連接多肽：
[0131]合成選用0.35mM修飾密度的Wang樹脂，其中第一個氨基酸(賴氨酸）的N端被Fmoc 保護(hù)，C端固定于樹脂上。用20%(v/v)的六氫吡啶的DMF溶液脫去N端的Fmoc保護(hù)，然后用茚 三酮測試法測試脫保護(hù)結(jié)果。然后將下一個氨基酸的羧基用0.4M的4-甲基嗎啉(NMM)和10 倍于氨基酸的苯并三氮唑-^『少'-四甲基脲六氟磷酸酯(耶1'1])的01^溶液活化，并加入 到脫去保護(hù)的樹脂中反應(yīng)2h。按此方法，將剩余的所有氨基酸都通過縮合反應(yīng)連接上去，形 成固定于樹脂的連接多肽。
[0132] (2)多肽在酶催化下的聚合。
[0133] 將合成好的聚合單體分子用HEPES緩沖溶液溶解，加入到配制好的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移 酶溶液中，37°C，150rmp下?lián)u床4h左右，谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶可以催化多肽鏈賴氨酸上氨基和谷 氨酰胺上羥酰胺基之間發(fā)生共價交聯(lián)，從而形成對熱敏感的類彈性蛋白納米凝膠，凝膠性 質(zhì)如圖6所示。
[0134] (3)該原位納米材料的組裝方法用于促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
[0135] 將聚合單體分子以濃度為600μΜ的最終濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)12h 后，用PBS將細(xì)胞反復(fù)清洗三次，然后用Cy5標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染細(xì)胞的肌動蛋白，并用熒光共 聚焦顯微鏡成像，成像溫度為37°C，可以看到對比沒有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的細(xì)胞，胞內(nèi)凝 膠的形成和塌縮使得肌動蛋白被大量破壞，促使細(xì)胞凋亡(如圖7(a)-(b)所示）。
[0136] 通過上述實施例可以看出，本發(fā)明提供的多肽單體分子可以在細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺 轉(zhuǎn)移酶催化下發(fā)生聚合，形成的聚肽具有類彈性蛋白性質(zhì)，可以在改變溫度的環(huán)境中發(fā)生 聚合物鏈的扭曲和纏繞，實現(xiàn)原位的納米超分子組裝以及可控地在細(xì)胞內(nèi)制備類彈性蛋白 納米材料，并實現(xiàn)成像或者疾病治療的功能。
[0137]
【申請人】聲明，本發(fā)明通過上述實施案例來說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于上述， 即不意味著本發(fā)明必須依賴上述才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明 的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落 在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種基于細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合的多肽單體分子，其特征在于，所述多肽單體分子由功 能分子、聚合活性位點和類彈性蛋白重復(fù)多肽構(gòu)成。2. 如權(quán)利要求1所述的多肽單體分子，其特征在于，所述聚合活性位點包括谷氨酰胺端 和賴氨酸端； 優(yōu)選地，所述多肽單體分子由功能分子、聚合活性位點的谷氨酰胺端、類彈性蛋白重復(fù) 多肽和聚合活性位點的賴氨酸端依次連接構(gòu)成。3. 如權(quán)利要求2所述的多肽單體分子，其特征在于，所述谷氨酰胺端序列表示為XQY;其 中，X表示除脯氨酸以外的氨基酸，優(yōu)選為疏水性氨基酸;Q表示谷氨酰胺;Y表示除帶負(fù)電的 氨基酸以外的氨基酸，優(yōu)選為疏水性氨基酸； 優(yōu)選地，所述谷氨酰胺端序列如SEQ ID NO. 1-2之一所示； 優(yōu)選地，所述類彈性蛋白重復(fù)多肽的序列如SEQ ID NO.3-30之一所示，優(yōu)選為SEQ ID NO. 24-30所示的序列。4. 如權(quán)利要求1-3之一所述的多肽單體分子，其特征在于，所述功能分子為成像分子 和/或藥物分子； 優(yōu)選地，所述成像分子為焚光成像分子、光聲成像分子或極性敏感分子中的任意一種 或至少兩種的組合，優(yōu)選為紫紅素18、焦脫鎂葉綠素、Cy5-Cy7或DBD分子中的任意一種或至 少兩種的組合； 優(yōu)選地，所述藥物分子為腫瘤化療分子和/或抗生素分子，優(yōu)選為阿霉素和/或萬古霉 素。5. 如權(quán)利要求1-4之一所述的多肽單體分子的聚合方法，其特征在于，所述多肽單體分 子的聚合是在活細(xì)胞內(nèi)通過酶催化反應(yīng)聚合而成。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化反應(yīng)的溫度為37-40Γ，優(yōu)選為37 °C； 優(yōu)選地，所述催化反應(yīng)的時間為4-12h，優(yōu)選為4h; 優(yōu)選地，所述多肽單體分子的濃度為10_50μΜ，優(yōu)選為50μΜ; 優(yōu)選地，所述酶的濃度為1-3U; 優(yōu)選地，所述酶與多肽單體分子的反應(yīng)摩爾比為1:5-1:10; 優(yōu)選地，所述酶為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶； 優(yōu)選地，所述谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶包括細(xì)菌提取的重組蛋白、人或動物組織中提取的TG2。7. -種細(xì)胞內(nèi)酶催化聚合構(gòu)建納米材料的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將如權(quán)利要求1-4之一所述的多肽單體分子配制成溶液； (2) 將步驟（1)得到的多肽單體分子溶液加入到酶溶液中，在溫度為4-40Γ條件下反應(yīng) 4-12h，得到納米材料。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述多肽單體分子溶液采用HEPES緩 沖溶液進(jìn)行配制； 優(yōu)選地，步驟（1)所述多肽單體分子溶液中多肽單體分子的濃度為100-1 ΟΟΟμΜ，優(yōu)選為 600μΜ； 優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)的溫度為37-40°C，優(yōu)選為37°C ; 優(yōu)選地，步驟(2)所述反應(yīng)的時間為4-8h，優(yōu)選為4h。9. 如權(quán)利要求7或8所述的方法制備得到的納米材料，其特征在于，所述納米材料為一 維和/或三維納米結(jié)構(gòu)； 優(yōu)選地，所述一維結(jié)構(gòu)的聚合單體兩端分別由谷氨酰胺端和賴氨酸端組成;所述三維 結(jié)構(gòu)的聚合單體兩端分別由谷氨酰胺-賴氨酸端和賴氨酸-谷氨酰胺端組成； 優(yōu)選地，所述谷氨酰胺端序列如SEQ ID NO. 1-2之一所示;所述谷氨酰胺-賴氨酸端序 列如SEQ ID NO.31所示;所述賴氨酸-谷氨酰胺端序列如SEQ IDN0.32所示。10. 如權(quán)利要求9所述的納米材料的用途，其特征在于，所述納米材料用于細(xì)胞內(nèi)谷氨 酰胺轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量成像或多肽緩釋藥物的遞送。
【文檔編號】C07K7/06GK106084003SQ201610408076
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】王浩, 李莉莉, 喬圣林, 劉偉嬌, 馬洋
【申請人】國家納米科學(xué)中心