一種產(chǎn)香真菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)香真菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域，所述的產(chǎn)香真菌是普通瘤座孢Tubercularia vulgaris GS?1，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期：2016年7月4日，保藏編號(hào)：CCTCC NO.M 2016369，該產(chǎn)香真菌可用于防治番茄灰霉病、水稻胡麻斑病、小麥赤霉病、白菜黑斑病、萵苣菌核病及番茄果實(shí)灰霉病，從而拓寬了多種植物病害的防治研究思路，在一定范圍內(nèi)解決了我國(guó)在生防菌劑開發(fā)和利用上受到的限制。CCTCC NO: M 201636920160704
【專利說明】
-種產(chǎn)香真菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體設(shè)及一種產(chǎn)香真菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 真菌揮發(fā)性物質(zhì)(volatile organic compounds,VOCs)是指真菌產(chǎn)生的各種含碳 氣態(tài)化合物的混合物，具有分子量小、易揮發(fā)、能在空氣和±壤中自由擴(kuò)散等特性。因其在 植物病害防治中具有獨(dú)特應(yīng)用價(jià)值而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和重視，研究和利用不同VOCs 控制植物病害已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。如通過熏蒸方式防治溫室作物病害、±傳病 害、果蔬采后病害和倉(cāng)儲(chǔ)糧食的霉變等。已報(bào)道廳香霉Muscodor、擬莖點(diǎn)霉Phomosis、多節(jié) 抱齡山11139〇1'；[加1、銳孔菌0巧901'113、木霉化;[油0(1日1'1]1日、梨抱假殼49；[0390招等多屬真菌的 揮發(fā)物具有抑制真菌、細(xì)菌等特性。內(nèi)生真菌白色廳香霉Muscodor a化US是目前研究最多 的產(chǎn)揮發(fā)物真菌之一，其揮發(fā)物能有效熏蒸抑制植物病原菌、水果和糧食霉腐真菌等，由于 內(nèi)生真菌白色廳香霉揮發(fā)物相對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中現(xiàn)有熏蒸劑具有更高的安全性，已被開發(fā)出 不同用途的巧巾"真菌熏蒸劑(Mycofumigation)"產(chǎn)品，顯示了利用真菌揮發(fā)物作為生物農(nóng) 藥的廣闊應(yīng)用前景。
[0003] 番茄灰霉病是由灰葡萄抱菌Botrytis cinerea引起的一種世界性的重要病害。除 在生育期造成果實(shí)腐爛外，在采后運(yùn)輸和儲(chǔ)藏過程亦可繼續(xù)造成危害，對(duì)番茄的生產(chǎn)和采 后保鮮構(gòu)成很大的威脅。相對(duì)于目前主要采用的化學(xué)防治方法，微生物等生物防治技術(shù)對(duì) 番茄保鮮和番茄灰霉病的防治具有更多優(yōu)勢(shì)。利用一些具抑菌活性的熏蒸作用，更有利于 保護(hù)地和采后番茄灰霉病的無公害防治。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種產(chǎn)香真菌，該產(chǎn)香真菌具有抑菌作用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案： 一種產(chǎn)香真菌，所述的產(chǎn)香真菌為普通瘤座抱(了山361^111日1'13￥111旨日1'13)65-1，已于 2016年7月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、(簡(jiǎn)稱:CCTCC，地址:湖北省武漢市武昌塔挪 山武漢大學(xué)保藏中屯、），保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2016369。
[0006] 產(chǎn)香真菌GS-1菌株在PDA培養(yǎng)基上25°C恒溫培養(yǎng)，5d長(zhǎng)滿全皿;第10天后菌落逐漸 產(chǎn)生米黃色點(diǎn)狀物，即分生抱子座，菌落反面黃褐色，直至正反面顏色變深，正面密布分生 抱子座。分生抱子梗大小36.3~52皿X 1.7~3皿，無色，長(zhǎng)條形，重復(fù)分枝，聚生呈球狀，頂 生分生抱子;分生抱子單細(xì)胞，無色，長(zhǎng)圓形至卵圓形，大小3.7~9.7]im X 1.7~3.3]im。
[0007] 產(chǎn)香真菌在抑制番茄灰霉病菌中的應(yīng)用。
[000引產(chǎn)香真菌在抑制水稻胡麻斑病菌中的應(yīng)用。
[0009] 產(chǎn)香真菌在抑制小麥赤霉病菌中的應(yīng)用。
[0010] 產(chǎn)香真菌在抑制白菜黑斑病菌中的應(yīng)用。
[0011] 產(chǎn)香真菌在抑制窩宦菌核病菌中的應(yīng)用。
[0012] 產(chǎn)香真菌在抑制番茄果實(shí)灰霉病中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的有益效果在于： 1. 本發(fā)明所述的產(chǎn)香真菌對(duì)5種植物病原真菌均有明顯的熏蒸抑制作用，從而拓寬了 多種植物病害的防治研究思路； 2. 本發(fā)明所述的產(chǎn)香真菌會(huì)對(duì)番茄灰霉病菌菌絲造成菌絲崎形、分枝增多、原生質(zhì)外 滲的影響，并且對(duì)番茄果實(shí)灰霉病有熏蒸抑制作用，表明其對(duì)番茄灰霉病有良好的生防效 果，為制備番茄果實(shí)灰霉病生防菌劑的研究起到了重要作用，在一定范圍內(nèi)解決了我國(guó)在 生防菌劑開發(fā)和利用上受到的限制。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明的產(chǎn)香真菌的形態(tài)學(xué)觀察，其中a為分生抱子座;b為分生抱子梗;C為 分生抱子。
[0015] 圖2為本發(fā)明的產(chǎn)香真菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹。
[0016] 圖3為本發(fā)明的產(chǎn)香真菌的對(duì)番茄灰霉病菌菌絲的影響圖，其中a為菌落邊緣不整 齊，產(chǎn)抱量大;b和C為菌絲稀疏，菌絲頂端尖細(xì);f為處理菌落邊緣整齊，菌絲在菌落邊緣密 集，產(chǎn)抱量少;d、e、g和h為菌絲增粗，局部不規(guī)則膨脹;e為菌絲頂端變純，分枝增多;g和h為 節(jié)間縮短，i和j為偶見原生質(zhì)外滲。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明： 下述實(shí)施例中所用的馬鈴馨葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養(yǎng)基配方為 馬鈴馨200g、葡萄糖20g、瓊脂粉15g、水lOOOmL。
[001引下述實(shí)施例中所用的化q DNA聚合酶、dNTPs、Buffer、上下游引物、d地20試劑購(gòu)自 寶生物工程化連巧限公司，DNA純化試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純，引物合成于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。
[0019] 下述實(shí)施例中所用的供試儀器:PTC200PCR(Polymerase Chain Reaction)為美國(guó) Bio-Rad公司；UB103i生物顯微鏡為重慶澳浦光電技術(shù)有限公司；HP-250S生化培養(yǎng)箱為武 漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。
[0020] 下述實(shí)施例中所用的番茄購(gòu)自市場(chǎng)，選取大小、成熟度等較為一致的新鮮番茄果 實(shí)。
[0021] 實(shí)施例1 一、產(chǎn)香真菌的分離培養(yǎng) 產(chǎn)香真菌是從構(gòu)樹化oussonetia papyrifera枯枝上分離得到的，構(gòu)樹枯枝采自信陽 農(nóng)林學(xué)院羊山校區(qū)。具體的分離培養(yǎng)步驟如下： a. 取構(gòu)樹枯枝4-5畑1，先用自來水沖洗3min，然后在無菌臺(tái)上用質(zhì)量濃度為75%的酒精 消毒3min，再無菌水漂洗=次，接著用尖頭綴子夾取構(gòu)樹枯枝上小黑點(diǎn)狀的分生抱子座放 到預(yù)先制好的含鏈霉素的PDA(每升PDA加入0.3g的鏈霉素)平板上，每個(gè)平板均勻擺放5點(diǎn)； b. 將上述PDA平板放到25 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天定時(shí)記錄平板上分離物的生長(zhǎng)情況； C.待3~4d后挑取長(zhǎng)出的菌絲到新鮮的PDA平板上純化，直到分離到單一菌株。
[0022] 二、產(chǎn)香真菌GS-1菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 產(chǎn)香真菌GS-1菌株在PDA培養(yǎng)基上25 °C恒溫培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)性狀。產(chǎn)香真菌GS-1菌株 在PDA上生長(zhǎng)較快，5d即長(zhǎng)滿全皿;如圖1-a所示，第10天后菌落逐漸產(chǎn)生米黃色點(diǎn)狀物，即 分生抱子座，菌落反面黃褐色，直至正反面顏色變深，正面密布分生抱子座。如圖1-b、C所 示，分生抱子梗大小36.3~52WI1X 1.7~3WI1，無色，長(zhǎng)條形，重復(fù)分枝，聚生呈球狀，頂生分 生抱子;分生抱子單細(xì)胞，無色，長(zhǎng)圓形至卵圓形，大小3.7~9.7]im X 1.7~3.3皿。根據(jù)形態(tài) 學(xué)特征，結(jié)合菌株分離來源，判斷該產(chǎn)香真菌GS-1菌株為普通瘤座抱。
[0023] S、產(chǎn)香真菌GS-1菌株的分子鑒定 真菌核糖體DNA提取采用真菌基因組DNA提取試劑盒。ITS rDNA基因序列的擴(kuò)增采用的 通用引物對(duì)為：ITS1-F: 5 '-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT-3 ' ； ITS4-R: 5 '-CCTCCGCTTATTGATATGC- 3'cPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10XBuffer 2化、5mmol/L dNTPs 1.化L、10pmol/L上下游引物各1 化、產(chǎn)香真菌的DNA 1.扣L、hgONA聚合酶0.化L，d地2〇 13化。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 4min;94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin，共 31 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 10min，16°C 保 溫1化。
[0024] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京S博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。將GS-1菌株的rDNA ITS序列測(cè)序后提交GenBank，收錄號(hào)為KP305907.1。
[002引將測(cè)得的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中應(yīng)用BLAST分析進(jìn)行同源性比較，并下載同源性 較高的序列，通過MegaS.O鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖2所示）。產(chǎn)香真菌GS-1菌株的rDNA ITS序列與叢赤殼化ctria cinnabarina菌株CBS 127386(GenBank收錄號(hào)：HM534894.1)，位 于同一進(jìn)化分枝，同源關(guān)系最近，為100%。因叢赤殼菌的無性態(tài)為普通瘤座抱，結(jié)合形態(tài)學(xué) 觀察，判斷該產(chǎn)香真菌GS-1菌株為普通瘤座抱。
[00%] 實(shí)施例2 一、產(chǎn)香真菌GS-1菌株對(duì)植物病原真菌的熏蒸抑制作用 該試驗(yàn)例采用對(duì)扣法測(cè)定，步驟是：W25°C條件下已培養(yǎng)5d的GS-1菌株作為供試的產(chǎn) 香菌株；用接種針分別挑取番茄灰霉病菌Bohytis cinerea、水稻胡麻斑病菌Bipolaris oryzae、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、白菜黑斑病菌Alternaria brassicae和窩 宦菌核病菌Sclerotinia sclerotiorumS種植物病原真菌與供試的產(chǎn)香真菌GS-1菌株接種 至化DA平板上，在25°C條件下培養(yǎng)7d，分別在5種植物病原真菌與供試的產(chǎn)香真菌GS-1菌株 的菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅;供試的產(chǎn)香真菌GS-1菌株在下，植物病原真菌在上，二者 對(duì)扣；W僅接種植物病原真菌的培養(yǎng)皿為對(duì)照，每隔24h觀察植物病原真菌的生長(zhǎng)情況，觀 察5d，并采用十字交叉法測(cè)量病原真菌菌落直徑，計(jì)算公式為:菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌 落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑X 100%。 表1產(chǎn)香真菌GS-1菌株對(duì)5種植物病原真菌的熏蒸抑制作用
表中數(shù)據(jù)均為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn) 在P<0.05水平差異顯著。 因?qū)φ找验L(zhǎng)滿全皿，無結(jié)果。
[0027] 如表1所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率有一定的變化，除對(duì)水稻胡麻斑病菌在 4化和7化的抑制率外，產(chǎn)香真菌GS-1菌株對(duì)其它4種植物病原真菌的抑制率均在60% W上。 在72h對(duì)供試植物病原真菌的抑制率為58.05 %~75.81 %。產(chǎn)香真菌GS-1菌株的對(duì)番茄灰 霉病菌的抑制率呈現(xiàn)逐漸降低又上升的趨勢(shì)，在24h抑制率為100 %，至72h抑制率為 75.64%，9化又上升至80.38%。對(duì)水稻胡麻斑病菌、小麥赤霉病菌和白菜黑斑病菌的抑制 率也呈現(xiàn)先下降又上升的趨勢(shì)，最低抑制率出現(xiàn)在4她，4她后抑制率逐漸上升。由于窩宦菌 核病菌對(duì)照菌落生長(zhǎng)較快，7化前已長(zhǎng)滿全皿，因此只統(tǒng)計(jì)了菌株對(duì)窩宦菌核病菌在2地和 4化的抑制率，即抑制率由24h的91.14%降到4化的76.66%。
[0028] 二、產(chǎn)香真菌GS-1菌株對(duì)病菌菌絲的影響 該試驗(yàn)例是采用顯微觀察法得到的，步驟是：W25°C條件下已培養(yǎng)5d的菌株作為供試 的產(chǎn)香真菌GS-1菌株;將產(chǎn)香真菌GS-1菌株和番茄灰霉病菌菌株分別接種到PDA培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，產(chǎn)香菌株培養(yǎng)9d，番茄灰霉病菌培養(yǎng)2d后;產(chǎn)香菌株在下，植物病原真菌在上，二者對(duì) 扣;4化后顯微觀察菌落邊緣菌絲形態(tài)。
[0029] 4化后，如圖3-a所示，對(duì)照的菌落邊緣不整齊，產(chǎn)抱量大;如圖3-b、C所示，菌絲稀 疏，菌絲頂端尖細(xì);如圖3-f所示，處理菌落邊緣整齊，菌絲在菌落邊緣密集，產(chǎn)抱量少;如圖 3-d、e、g、h所示，菌絲增粗，局部不規(guī)則膨脹;如圖3-e所示，菌絲頂端變純;如圖3-g、h所示， 分枝增多，節(jié)間縮短;如圖3-i、j所示，偶見原生質(zhì)外滲。
[0030] S、產(chǎn)香真菌GS-1菌株對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的熏蒸抑制作用 該試驗(yàn)例是通過果實(shí)針刺法測(cè)定的，步驟是:倒入40mL PDA培養(yǎng)基于1L滅菌圓形飯盒， 再接種直徑為5mm的產(chǎn)香真菌GS-1菌株菌餅，蓋上蓋子，密封，在生化培養(yǎng)箱25 °C培養(yǎng)14d; 選取大小、成熟度等較為一致的番茄果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用自來水沖洗，驚干，消毒，無菌水 沖洗3次，風(fēng)干，然后在番茄果實(shí)表面打直徑5mm，深度約5mm的圓孔;接種直徑為5mm的番茄 灰霉病菌菌餅，使番茄果實(shí)感染番茄灰霉病菌，菌面朝外;將感染了番茄灰霉病菌的番茄果 實(shí)放入培養(yǎng)產(chǎn)香真菌GS-1菌株14d的圓形飯盒，25°C條件下倒置培養(yǎng)，W空白PDA培養(yǎng)基為 對(duì)照，重復(fù)8次，7化后用直尺十字交叉法測(cè)量病斑直徑，計(jì)算公式為:防病效果=(對(duì)照病斑 平均直徑-處理病斑平均直徑)/對(duì)照病斑平均直徑X 100%。產(chǎn)香真菌GS-1菌株培養(yǎng)14d后， 其對(duì)番茄果實(shí)的番茄果實(shí)灰霉病的防病效果在72h后達(dá)53.62±2.44%。
[0031] W上所述只是本發(fā)明較佳實(shí)施例，僅僅用W解釋本發(fā)明，并非限制本發(fā)明實(shí)施范 圍，故凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包括于本發(fā) 明申請(qǐng)專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種產(chǎn)香真菌，其特征在于，所述的產(chǎn)香真菌為普通瘤座孢（rt/Aercuiaria ^/^?ariS)GS-l，保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期:2016年7月4日，保藏編號(hào)： CCTCC NO.Μ 2016369〇2. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)香真菌在抑制番茄灰霉病菌中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)香真菌在抑制水稻胡麻斑病菌中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)香真菌在抑制小麥赤霉病菌中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)香真菌在抑制白菜黑斑病菌中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)香真菌在抑制萵苣菌核病菌中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的產(chǎn)香真菌在抑制番茄果實(shí)灰霉病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK106047727SQ201610559682
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】陳利軍, 陳月華, 智亞楠, 王國(guó)君, 張方梅, 郭世保
【申請(qǐng)人】信陽農(nóng)林學(xué)院