一種中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基及方法。本發(fā)明通過(guò)以泥炭土為主要的基質(zhì),添加適量的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液,制備適合被毛孢生長(zhǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基,被毛孢可以在培養(yǎng)基內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng),且分生孢子分離提取容易,可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子;還能方便蝙蝠蛾幼蟲(chóng)侵染,應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草的繁育;同時(shí)本發(fā)明還提供了在泥炭土培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢的方法,通過(guò)適當(dāng)?shù)母淖兺饨鐥l件,刺激中國(guó)被毛孢無(wú)性繁殖來(lái)增加孢子量,和/或進(jìn)一步的增加分生孢子誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)中國(guó)被毛孢無(wú)性繁殖來(lái)增加分生孢子量。
【專利說(shuō)明】
一種中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種適用于中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基及方法。
技術(shù)背景
[0002]目前已證實(shí)冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型是中國(guó)被毛孢Hirsutellasinensis X.J.Liu ,Y.L.Guo,Y.X.Yu&W.Zeng(蔣毅和姚一建2003;李增智等2000;劉錫琎等1989)。中國(guó)被毛孢液體發(fā)酵已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn),并開(kāi)發(fā)了百令膠囊、百令片等產(chǎn)品(Dong et al.2015;董彩虹等2015),但生產(chǎn)實(shí)際中發(fā)現(xiàn)中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)緩慢,長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)導(dǎo)致污染幾率增高,同時(shí)還增加代謝物的復(fù)雜性和風(fēng)險(xiǎn)性(李淑林等2014)。因此,模擬高原生態(tài)繁育冬蟲(chóng)夏草成為迫切的需要。
[0003]冬蟲(chóng)夏草的繁育首先需要得到大量用于侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的分生孢子。由于中國(guó)被毛孢菌種特性復(fù)雜,現(xiàn)有的發(fā)酵工藝下,目前只有為數(shù)不多的有關(guān)利用中國(guó)被毛孢來(lái)制備分生孢子的報(bào)道,文獻(xiàn)中的方法都是進(jìn)行固體斜面培養(yǎng)獲得菌落的分生孢子(李玉玲2002;王偉等2002;王燦2012;李玲玲等2014;朱志鋼2014)?,F(xiàn)有中國(guó)被毛孢制備分生孢子方法基本是在試管、培養(yǎng)皿或者廣口瓶固體斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行,培養(yǎng)基通透性差,中國(guó)被毛孢難以在培養(yǎng)基內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng),而且培養(yǎng)基在實(shí)際生產(chǎn)中不能應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草的繁育,受到培養(yǎng)基本身材質(zhì)以及培養(yǎng)容器的空間限制,培養(yǎng)基與中國(guó)被毛孢菌落分離困難,分生孢子分離提取需要將菌落剝離培養(yǎng)基,在進(jìn)行菌絲與分生孢子分離,步驟繁瑣,難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?;?。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明通過(guò)以泥炭土為主要的基質(zhì),添加適量的基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液,制備適合被毛孢生長(zhǎng)的固體發(fā)酵培養(yǎng)基,被毛孢可以在培養(yǎng)基內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng),且分生孢子分離提取容易,可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子;還能方便蝙蝠蛾幼蟲(chóng)侵染,應(yīng)用于冬蟲(chóng)夏草的繁育;同時(shí)本發(fā)明還提供了在泥炭土培養(yǎng)基中培養(yǎng)中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢的方法,通過(guò)適當(dāng)?shù)母淖兺饨鐥l件,刺激中國(guó)被毛孢無(wú)性繁殖來(lái)增加孢子量,和/或進(jìn)一步的增加分生孢子誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)中國(guó)被毛孢無(wú)性繁殖來(lái)增加分生孢子量。
[0005]—方面,本發(fā)明提供了一種中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基,其特征是包括:泥炭土和營(yíng)養(yǎng)液。泥炭土培養(yǎng)基中基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分被菌絲吸收殆盡后,培養(yǎng)基疏松寡營(yíng)養(yǎng)的特殊條件能促進(jìn)中國(guó)被毛孢分生孢子的形成,因而中國(guó)被毛孢氣生菌絲的生長(zhǎng)一般產(chǎn)生分生孢子較多。泥炭土培養(yǎng)基固體發(fā)酵制備分生孢子不僅能規(guī)?;沂褂梅奖?,菌絲還可在其內(nèi)部生長(zhǎng);該培養(yǎng)基培養(yǎng)的中國(guó)被毛孢不僅能直接作為蝙蝠蛾幼蟲(chóng)侵染的菌種,也可作為蝙蝠蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)和活動(dòng)的棲息地,為冬蟲(chóng)夏草人工培育的規(guī)?;?、現(xiàn)代化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0006]在一些實(shí)施例中,所述泥炭土為松散、纖維物粗細(xì)均勻的泥炭土。
[0007]在一些實(shí)施例中,所述泥炭土中無(wú)機(jī)物控制為10?15%,pH控制為6?7。
[0008]在一些實(shí)施例中,所述泥炭土為松散、纖維物粗細(xì)均勻的泥炭土,其中無(wú)機(jī)物控制為10?15%,pH控制為6.5。
[0009]在一些實(shí)施例中,所述培養(yǎng)基進(jìn)一步的包括蛹?xì)し邸?br>[0010]在一些實(shí)施例中,所述營(yíng)養(yǎng)液包括蛋白胨、酵母粉、蔗糖、無(wú)水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素C和水。
[0011 ] 在另一些實(shí)施例中,所述營(yíng)養(yǎng)液包括0.10?0.50g/100mL的蛋白胨、0.1?0.50g/10mL的酵母粉、I?2g/100mL的鹿糖、0.01?0.05g/100mL的無(wú)水硫酸鎂、0.1?0.50g/10mL的磷酸二氫鉀、0.1?0.50g/100mL的維生素C和水。該配方的營(yíng)養(yǎng)液在保證泥炭土為基質(zhì)的培養(yǎng)基通透性的基礎(chǔ)上,提供了中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)到一定階段所需的營(yíng)養(yǎng)成分。
[0012]在另一些實(shí)施例中,在所述營(yíng)養(yǎng)液中,蛋白胨為0.10g/100mL、0.20g/100mL、0.30g/100mL、0.40g/100mL或0.50g/100mL,酵母粉為0.lg/100mL、0.20g/100mL、0.30g/100mL、0.40g/100mL或0.50g/100mL,蔗糖為I.0g/100mL、I.2g/100mL、I.4g/100mL、I.6g/100mL、1.8g/100mL或 2.0g/100mL,無(wú)水硫酸鎂為 0.01g/100mL、0.02g/100mL、0.03g/100mL、0.04g/100mL或0.05g/100mL,磷酸二氫鉀為0.lg/100mL、0.2g/100mL、0.3g/100mL、0.4g/10mL或0.5g/100mL,維生素C為0.lg/100mL、0.2g/100mL、0.3g/100mL、0.4g/100mL或0.5g/10mLo
[0013]在另一些實(shí)施例中,所述蛹?xì)し蹫榕囵B(yǎng)基質(zhì)量2%。
[0014]在一些實(shí)施例中,所述培養(yǎng)基進(jìn)一步的包括培養(yǎng)基質(zhì)量2%的蛹?xì)し?,且所述營(yíng)養(yǎng)液包括0.10?0.5(^/100!1^的蛋白胨、0.1?0.5(^/1001^的酵母粉、1?28/1001^的蔗糖、0.01 ?0.05g/100mL的無(wú)水硫酸鎂、0.I?0.50g/100mL的磷酸二氫鉀、0.I?0.50g/100mL的維生素C和水。
[0015]在一些實(shí)施例中,本發(fā)明所述的培養(yǎng)基是將所述泥炭土和營(yíng)養(yǎng)液以一定比例混合后進(jìn)行滅菌。
[0016]在一些實(shí)施例中,其中,所述泥炭土:營(yíng)養(yǎng)液= 100:15?10;滅菌在115?121°C進(jìn)行2?3小時(shí)。中國(guó)被毛孢的菌絲在該比例的所述泥炭土和營(yíng)養(yǎng)液下更適合生長(zhǎng)。
[0017]在一些實(shí)施例中,其中,所述蛹?xì)し凼窃谒瞿嗵客梁蜖I(yíng)養(yǎng)液混合滅菌后加入。
[0018]在一些實(shí)施例中,其中,所述蛹?xì)し蹫閱为?dú)滅菌。
[0019]在一些實(shí)施例中,其中,所述單獨(dú)滅菌的蛹?xì)し凼抢铆h(huán)氧丙烷進(jìn)行熏蒸消毒,200g/m3熏蒸12小時(shí)。
[0020]在另一些實(shí)施例中,其中,所述泥炭土:營(yíng)養(yǎng)液=100:15?10;配制好后在115?121°C滅菌2?3小時(shí);再加入單獨(dú)滅菌的蛹?xì)し邸?br>[0021]在另一些實(shí)施例中,所述單獨(dú)滅菌的蛹?xì)し郯凑张囵B(yǎng)基質(zhì)量2%的量加入培養(yǎng)基。
[0022]另一方面,本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法,包括:
[0023]I)接種中國(guó)被毛孢液體菌種到所述培養(yǎng)基;
[0024]2)將步驟I)中接種了的培養(yǎng)基置于無(wú)菌恒溫暗室中培養(yǎng);和
[0025]3)降低培養(yǎng)溫度培養(yǎng)。
[0026]通過(guò)使用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基,采用上述產(chǎn)分生孢子的方法,使得中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子能實(shí)現(xiàn)規(guī)?;?,而且方便。
[0027]在一些實(shí)施例中,所述步驟I)中接種中國(guó)被毛孢液體菌種的接種量是10?15%V/W的菌絲體,其濕重菌絲體濕重為15?20%。
[0028]在一些實(shí)施例中,所述步驟2)中培養(yǎng)溫度控制范圍為18?22°C,培養(yǎng)時(shí)間為30?35天,濕度控制范圍為60?80%。
[0029]在一些實(shí)施例中,所述步驟3)中培養(yǎng)溫度控制范圍為4?10°C,培養(yǎng)時(shí)間為35?45天,濕度控制范圍為60?75%。
[0030]在一些實(shí)施例中,在本發(fā)明所述的使用本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵中國(guó)被毛孢產(chǎn)生孢子的方法中,其中:
[0031 ]步驟I)中接種中國(guó)被毛孢液體菌種的接種量是1?15 % V/W的菌絲體,其濕重菌絲體濕重為15?20% ;
[0032]步驟2)中培養(yǎng)溫度控制范圍為18?22V,培養(yǎng)時(shí)間為30?35天,濕度控制范圍為60?80% ;和
[0033]步驟3)中培養(yǎng)溫度控制范圍為4?10°C,培養(yǎng)時(shí)間為35?45天,濕度控制范圍為60?75%。
[0034]在一些實(shí)施例中,在本發(fā)明所述的使用本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵中國(guó)被毛孢產(chǎn)生孢子的方法中,步驟2)中培養(yǎng)溫度控制范圍為18°C,培養(yǎng)時(shí)間為30天,濕度控制范圍為75% ;和步驟3)中培養(yǎng)溫度控制范圍為4°C,培養(yǎng)時(shí)間為40天,濕度控制范圍為65 %。
[0035]在一些實(shí)施例中,本發(fā)明所述的使用本發(fā)明所述培養(yǎng)基發(fā)酵中國(guó)被毛孢產(chǎn)生孢子的方法包括在步驟3)中降溫后進(jìn)一步地添加分生孢子誘導(dǎo)劑。在所述培植方法中,進(jìn)一步的加入分生孢子誘導(dǎo)劑,能促使中國(guó)被毛孢無(wú)性繁殖。
[0036]在另一些實(shí)施例中,所述分生孢子誘導(dǎo)劑為茶多酚。茶多酚為天然抑菌劑,作為分生孢子誘導(dǎo)劑綠色無(wú)毒害。
[0037]在另一些實(shí)施例中,所述分生孢子誘導(dǎo)劑包括茶多酚、維生素B1、維生素B6和維生素H。維生素B1、維生素B6和維生素H能進(jìn)一步的促使中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子,從而提供分生孢子的產(chǎn)量。
[0038]在另一些實(shí)施例中,所述分生孢子誘導(dǎo)劑包括0.04?0.08g/100mL的茶多酚、0.01?0.03g/100mL 的維生素 B1、0.02 ?0.04g/100mL 的維生素 B6、0.02 ?0.04g/100mL 的維生素H和水。
[0039]在另一些實(shí)施例中,所述分生孢子誘導(dǎo)劑包括0.04g/100mL的茶多酚、0.0lg/10mL的維生素B1、0.02g/100mL的維生素B6、0.02g/100mL的維生素H和水。
[0040]在另一些實(shí)施例中,所述分生孢子誘導(dǎo)劑的用量為10mL/500g培養(yǎng)基。此范圍內(nèi)的分生孢子誘導(dǎo)劑的量能較好的觸發(fā)中國(guó)被毛孢的抗逆性。
[0041]本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)液是為中國(guó)被毛孢發(fā)酵生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和其他生長(zhǎng)所需物質(zhì)的基本溶液。
[0042]本發(fā)明所述的分生孢子誘導(dǎo)劑是能夠在一定程度上抑制中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)的。
[0043]本發(fā)明所述的液體菌種,是通過(guò)選取長(zhǎng)勢(shì)良好的中國(guó)被毛孢試管菌株,并挑取Icm2左右大小的菌塊接種于液體搖瓶,發(fā)酵完成搗碎后接種于發(fā)酵罐,以獲得大量的液體菌種;接種中國(guó)被毛孢液體菌種的菌絲體濕重測(cè)定參數(shù):1mL發(fā)酵液3000rpm,15min離心后,菌絲體占發(fā)酵液的體積。
【附圖說(shuō)明】
[0044]圖1所示為本發(fā)明所制備的中國(guó)被毛孢栽培盒生長(zhǎng)圖
[0045]圖2所示為本發(fā)明所制備的中國(guó)被毛孢分生孢子的鏡檢圖
[0046]具體實(shí)施例方式
[0047]本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種制備中國(guó)被毛孢成熟分生孢子的培養(yǎng)基和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容,適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是,所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的,它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述,相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合,來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0048]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明,下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種制備中國(guó)被毛孢成熟分生孢子的培養(yǎng)基和方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例
[0049]I)配制分生孢子誘導(dǎo)劑:
[0050]分生孢子誘導(dǎo)劑由0.04g/100mL的茶多酚、0.01g/100mL的維生素B1、0.02g/100mL的維生素B6、0.02g/100mL的維生素H攪拌均勻組成,余量水補(bǔ)足。
[0051 ] 2)配制泥炭土培養(yǎng)基
[0052]選取松散、纖維物粗細(xì)均勻的泥炭土,用水進(jìn)行浸泡和清洗,將其泥炭土的無(wú)機(jī)物控制為1?15 %,pH控制為6.5,進(jìn)行100 °C烘干8小時(shí)裝袋密封備用。營(yíng)養(yǎng)液由0.1 Og/1 OOmL的蛋白胨、0.1 g/1 OOmL的酵母粉、I g/1 OOmL的鹿糖、0.0I g/1 OOmL的無(wú)水硫酸鎂、0.lg/10mL的磷酸二氫鉀、0.lg/100mL的維生素C攪拌均勻組成,余量水補(bǔ)足。用營(yíng)養(yǎng)液將泥炭土調(diào)節(jié)至IJlO?15%的濕度,按照500g每盒的裝量進(jìn)行配制。配制好后于121°C滅菌2小時(shí)。蛹?xì)し蹎为?dú)滅菌(利用環(huán)氧丙烷進(jìn)行熏蒸消毒,200g/m3熏蒸12h),接種時(shí)按照培養(yǎng)基質(zhì)量比2%的量加入培養(yǎng)基中。
[0053]中國(guó)被毛孢菌株為從新鮮的野生冬蟲(chóng)夏草上分離獲得。接種中國(guó)被毛孢液體菌種到配制好的泥炭土培養(yǎng)基,接種量是15%V/W的菌絲體,其濕重菌絲體濕重為15?20%,將接種的培養(yǎng)基置于無(wú)菌恒溫暗室中,在溫度18°C,濕度75 %下,培養(yǎng)中國(guó)被毛孢菌,30天后,培養(yǎng)基內(nèi)外布滿白色氣生菌絲;降低培養(yǎng)溫度到4°C,濕度為65%,添加上述配制的分生孢子誘導(dǎo)劑后培養(yǎng),40天后,經(jīng)取樣鏡檢可明顯看到大量成熟散落的中國(guó)被毛孢腎形分生孢子。
[0054]用接種針直接挑取不同部位的固體發(fā)酵菌絲塊,并計(jì)下重量,用吐溫80液洗下分生孢子,離心(1000r/min,15分鐘)收集,再用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù),平均每一克固體培養(yǎng)基所含的中國(guó)被毛孢分生孢子量為4.0 X 19?8.0XlO9,每一盒泥炭土培養(yǎng)基含中國(guó)被毛孢分生孢子為2.0 X 112?4.0 X 112。
[0055]以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾,這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種中國(guó)被毛孢固體發(fā)酵產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基,其特征是包括:泥炭土和營(yíng)養(yǎng)液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征是所述泥炭土為松散、纖維物粗細(xì)均勻的泥炭土,其中無(wú)機(jī)物控制為1?15 %,pH控制為6.5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征是所述培養(yǎng)基進(jìn)一步的包括培養(yǎng)基質(zhì)量2%的蛹?xì)し?,且所述營(yíng)養(yǎng)液包括0.10?0.50g/100mL的蛋白胨、0.1?0.50g/100mL的酵母粉、I?2g/100mL的蔗糖、0.01?0.058/1001^的無(wú)水硫酸鎂、0.1?0.5(^/1001^的磷酸二氫鉀、0.1?0.50g/100mL的維生素C和水。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基,其特征是所述泥炭土:營(yíng)養(yǎng)液=1O: 15?1;配制好后在115?121°C滅菌2?3小時(shí);再加入單獨(dú)滅菌的蛹?xì)し邸?.—種使用如權(quán)利要求1 - 4中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基發(fā)酵中國(guó)被毛孢產(chǎn)分生孢子的方法,其特征是包括: 1)接種中國(guó)被毛孢液體菌種到所述培養(yǎng)基; 2)將步驟I)中接種了的培養(yǎng)基置于無(wú)菌恒溫暗室中培養(yǎng);和 3)降低培養(yǎng)溫度培養(yǎng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征是: 步驟I)中接種中國(guó)被毛孢液體菌種的接種量是10?15 %V/W的菌絲體,其濕重菌絲體濕重為15?20% ; 步驟2)中培養(yǎng)溫度控制范圍為18?22°C,培養(yǎng)時(shí)間為30?35天,濕度控制范圍為60?80%;和 步驟3)中培養(yǎng)溫度控制范圍為4?10 °C,培養(yǎng)時(shí)間為35?45天,濕度控制范圍為60?75%。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法,其特征是步驟3)中包括降溫后進(jìn)一步地添加分生孢子誘導(dǎo)劑。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其特征是所述分生孢子誘導(dǎo)劑為茶多酚。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其特征是所述分生孢子誘導(dǎo)劑包括茶多酚、維生素B1、維生素B6和維生素H。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其特征是所述分生孢子誘導(dǎo)劑包括0.04?0.0Sg/10mL的茶多酚、0.01 ?0.03g/100mL的維生素B1、0.02?0.04g/100mL的維生素B6、0.02?0.04g/100mL的維生素H和水。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其特征是所述分生孢子誘導(dǎo)劑的用量為10mL/500g培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK105838659SQ201610214162
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年4月6日
【發(fā)明人】李文佳, 張宗耀, 李全平, 呂延華, 梁關(guān)海
【申請(qǐng)人】廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司, 宜昌山城水都冬蟲(chóng)夏草有限公司