一種快速獲得三七圓斑病菌分生孢子的活體接種產(chǎn)孢方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種快速獲得=屯圓斑病菌分生抱子的活 體接種產(chǎn)抱方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 械菌刺抱MyCOCentrospora ace;rina(R. Ha;rtig)Deighton[ =Centrospora ace;rina(R.Ha;rtig)A.G.Newhall]，其分類地位為子囊菌口Ascomycota座囊菌綱 Dothideomycetes 球腔菌科 Mycosphaerel Iaceae 菌刺抱屬 Mycocentrospora，可寄生于淡水 流域的沉水植物上也侵染陸地寄主植株引起植物病害，該菌寄主范圍廣泛，危害嚴(yán)重，在國(guó) 外主要引起=色堇葉斑病、歐芹儲(chǔ)藏期腐爛病、胡蘿h根腐病、牛募潰瘍病及冠腐病等病害， 該病原于上世紀(jì)90年代初傳入我國(guó)，侵染藥用植物細(xì)辛，引起細(xì)辛葉枯病。據(jù)調(diào)查報(bào)道1993 年開(kāi)始侵染=屯植株，導(dǎo)致=屯圓斑病，此后=屯圓斑病逐年擴(kuò)大，目前已成為=屯病害中 的重要葉部病害之一。
[0003] S屯(Panaxnotoginseng)為五加科人參屬多年生草本宿根植物，是一種原產(chǎn)我國(guó) 的名貴中藥材，在傳統(tǒng)露天蔭棚的=屯種植園中=屯圓斑病在雨季普遍發(fā)生，一旦發(fā)病，從 開(kāi)始發(fā)病到發(fā)病高峰期病程短，發(fā)病迅猛、毀滅性強(qiáng)，常年平均發(fā)病率在30 %左右，雨季來(lái) 臨時(shí)若管理不善發(fā)病率可高達(dá)60% W上，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)70% W上，甚至毀園。因此，械 菌刺抱是一種重要的病原。隨著=屯生產(chǎn)種植范圍的逐年擴(kuò)大，該病的發(fā)生也愈加普遍，在 化學(xué)防治方面，每年的農(nóng)藥施用量也出現(xiàn)了增加，該病原是否發(fā)生了變異未有相關(guān)報(bào)道。目 前暫無(wú)關(guān)于械菌刺抱侵染=屯的病理學(xué)報(bào)道，由于其分生抱子的人工誘導(dǎo)不易，從而滯后 了械菌刺抱Mycocentrospora acerina分類學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。
[0004] 械菌刺抱分生抱子的產(chǎn)生方式特殊，其分生抱子的誘導(dǎo)一直W來(lái)都是難題，械菌 刺抱在人工培養(yǎng)基上不易產(chǎn)生分生抱子，偶見(jiàn)國(guó)外學(xué)者報(bào)道械菌刺抱在人工培養(yǎng)基如 (PDA、1/4PDA、V8汁培養(yǎng)基等)上可產(chǎn)生分生抱子的研究報(bào)道，但并沒(méi)有詳細(xì)的描述;而國(guó)內(nèi) 學(xué)者則普遍認(rèn)為械菌刺抱在人工培養(yǎng)基上不能產(chǎn)生分生抱子。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道了多種產(chǎn) 抱方法可誘導(dǎo)分生抱子的產(chǎn)生，但都存在局限性、重復(fù)性差、產(chǎn)抱量少等問(wèn)題。
[0005] 現(xiàn)有已報(bào)道的械菌刺抱的產(chǎn)抱技術(shù)方案：
[0006] ①翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基法:有學(xué)者認(rèn)為將已長(zhǎng)滿菌落的培養(yǎng)基翻轉(zhuǎn)，使菌絲穿過(guò)培養(yǎng)基生 長(zhǎng)可W產(chǎn)生分生抱子。
[0007] ②新鮮罹病組織保濕法:Neergaard (1951)將田間發(fā)病植株的罹病組織才回室內(nèi) 后，取小塊罹病組織保濕培養(yǎng)，可產(chǎn)生大量的分生抱子。
[000引③低溫紫外培養(yǎng)法:Lawrie(1999)將培養(yǎng)在PDA平板上的械菌刺抱菌落經(jīng)低溫18 °C紫外光連續(xù)照射培養(yǎng)IOd后可產(chǎn)生大型分生抱子。
[0009]④菌塊水滴保濕法:傅俊范（1995)采用PDA或V8汁培養(yǎng)基平板菌塊切割，水滴保濕 培養(yǎng)方法，成功誘導(dǎo)了分生抱子的產(chǎn)生，但并未說(shuō)明產(chǎn)生了多少分生抱子，陸寧(2005)年采 用此方法在18°C全光照的條件下4她誘導(dǎo)了 47個(gè)分生抱子。
[0010] ⑤胡蘿h產(chǎn)抱法(此方案是與本技術(shù)發(fā)明最相近似的方案）：Louarn(2012)將械菌 刺抱菌餅接至經(jīng)高溫蒸汽滅菌的胡蘿h主根上，于裝有IOOmL無(wú)菌水的無(wú)菌錐形瓶中2(TC培 養(yǎng)3周后產(chǎn)生分生抱子。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)抱技術(shù)方案的缺陷為：
[0012] ①翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基法
[0013] 缺點(diǎn):傅俊范（1994)認(rèn)為該種方法只對(duì)新鮮分離的病原菌有效。
[0014] ②新鮮罹病組織保濕法 [001引缺點(diǎn):此種方法具有時(shí)限性。
[0016] ③低溫紫外培養(yǎng)法
[0017] 缺點(diǎn):經(jīng)紫外線處理后的菌株可能會(huì)導(dǎo)致變異。
[0018] ④菌塊濾紙保濕法
[0019] 缺點(diǎn)：采用該種方法產(chǎn)抱量過(guò)少，短暫性，不能滿足常規(guī)的試驗(yàn)研究需要，對(duì)于不 同的分離菌株不穩(wěn)定，僅對(duì)于部分菌株有效，且不易將產(chǎn)生的分生抱子洗下，且4她后分生 抱子已全部萌發(fā)，菌塊失去產(chǎn)抱能力。
[0020] ⑤胡蘿h產(chǎn)抱法
[0021] 缺點(diǎn)：此種方法的培養(yǎng)周期時(shí)間長(zhǎng)，比本技術(shù)發(fā)明的產(chǎn)抱時(shí)間要長(zhǎng)1個(gè)月左右，且 分生抱子在產(chǎn)抱的過(guò)程中很容易萌發(fā)，且對(duì)于不同的菌株此法不一定都有效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有方法在械菌刺抱產(chǎn)抱方面的不穩(wěn)定性、周期長(zhǎng)和產(chǎn)抱量 過(guò)少等問(wèn)題，通過(guò)研究其分生抱子的產(chǎn)生對(duì)環(huán)境條件的需求特性，找出一種快速獲得=屯 圓斑病菌分生抱子的活體接種產(chǎn)抱方法，W期通過(guò)此方法在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定地有效誘導(dǎo)出較 多的分生抱子。
[0023] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0024] -種快速獲得=屯圓斑病菌分生抱子的活體接種產(chǎn)抱方法，包括W下步驟：
[0025] 步驟1:病原菌的培養(yǎng):無(wú)菌條件下，用打孔器分別打取械菌刺抱單抱菌株的菌餅 接種至培養(yǎng)基上，置于一定溫度下光照培養(yǎng)箱中全光照連續(xù)培養(yǎng)15d，W供產(chǎn)抱接種使用；
[0026] 步驟2:產(chǎn)抱裝置:挑選健康無(wú)病的一年生S屯植株，用75%乙醇進(jìn)行噴霧表面消 毒，再用無(wú)菌水沖洗干凈，將消毒好的=屯植株移栽至盛有滅菌基質(zhì)的育苗盆中，接種后用 將容器和植株一同罩住的自封袋袋口朝上套上即可，小型噴霧器噴霧保濕后，密封好自封 袋的袋口；
[0027] 步驟3 :接種葉片:取按照步驟一培養(yǎng)好的純培養(yǎng)菌株，用打孔器打取的菌餅，在步 驟二的葉片中央用無(wú)菌針刺傷一個(gè)小點(diǎn)，將打好的菌餅移至已刺傷的葉片中央，用無(wú)菌水 對(duì)已接種的葉片進(jìn)行噴霧保濕，置于2(TC光照培養(yǎng)箱中，全光照培養(yǎng)，持續(xù)保濕；
[00%]步驟4:分生抱子的誘導(dǎo)：2-3dW后，當(dāng)菌絲侵染葉片形成明顯肉眼可見(jiàn)的病斑后， 隨即去除菌餅，繼續(xù)噴霧保濕，于接種后6d開(kāi)始在病斑處產(chǎn)抱，IOd后每個(gè)葉片上產(chǎn)生的分 生抱子達(dá)IO4個(gè)左右，分生抱子產(chǎn)生后若要使用應(yīng)及時(shí)將其用無(wú)菌水洗下，每個(gè)產(chǎn)抱的葉片 用移液器吸取ImL無(wú)菌水進(jìn)行沖洗即可，每個(gè)葉片可得到ImL的分生抱子懸浮液。
[0029]優(yōu)選地，所述步驟1中的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、V8汁培養(yǎng)基、胡蘿h培養(yǎng)基、麥芽浸膏 培養(yǎng)基、=屯煎汁培養(yǎng)基中的一種或幾種混合物。
[0030] 優(yōu)選地，所述步驟1 中的溫度條件為4°C、8°C、12°C、16°C、18°C、20°C、22°C、24°C、 28°(：或32°(：。
[0031] 優(yōu)選地，所述步驟I中的打孔器孔直徑為5mm。
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:在較短的時(shí)間內(nèi)有效獲得可供科學(xué)試驗(yàn) 研究的械菌刺抱的分生抱子，確保試驗(yàn)的穩(wěn)定性、可操作性和可重復(fù)性。本技術(shù)將為械菌刺 抱的分類鑒定學(xué)研究、藥效試驗(yàn)及病理學(xué)研究等科學(xué)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)技術(shù)支撐。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0034] 1、步驟一--病原菌的培養(yǎng):無(wú)菌條件下，用打孔器（〇=5cm)分別打取械菌刺抱 單抱菌株的菌餅接種至PDA平板上，置于2(TC光照培養(yǎng)箱中全光照連續(xù)培養(yǎng)15d，W供產(chǎn)抱 接種使用。
[00巧]1.1技術(shù)方案設(shè)計(jì)
[0036] 1.1.1病原菌培養(yǎng)溫度條件篩選用打孔器（O =5mm)從上述方法培養(yǎng)的械菌刺抱 單抱菌落邊緣處打取菌餅，將菌餅朝下移至PDA平板的中央，分別置于4°C、8°C、12°C、16°C、 18°C、20°C、22°C、24°C、28°C、32°C共10個(gè)溫度條件下暗培養(yǎng)，共11個(gè)溫度處理，每處理接5 個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次。純生長(zhǎng)量=菌落平均直徑一菌餅直徑。
[0037] 1.1.2光照條件篩選設(shè)全光照、光暗交替、全黑暗共3個(gè)處理，供試菌株為按照 1.1.1中培養(yǎng)的械菌刺抱單抱菌株，每處理接5個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次，8d后測(cè)量菌落直徑。
[0038] 1.1.3產(chǎn)抱培養(yǎng)基篩選設(shè)常見(jiàn)的PDA培養(yǎng)基、V8汁培養(yǎng)基、胡蘿h培養(yǎng)基(CA)、麥芽 浸膏培養(yǎng)基(MEA)、=屯煎汁培養(yǎng)基共5種供試產(chǎn)抱培養(yǎng)基處理，供試菌株為按照1.1.1中培 養(yǎng)的械菌刺抱單抱菌株，每處理20個(gè)培養(yǎng)皿，重復(fù)3次，培養(yǎng)條件為2(TC全光照培養(yǎng)，進(jìn)行械 菌刺抱在人工培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分生抱子觀察試驗(yàn)。
[0039] 1.2 結(jié)果 適宜于械菌刺抱菌絲生長(zhǎng)的最佳溫度為20-22°C (如表1所示），全光照和光暗交替培養(yǎng) 均可促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，二者無(wú)顯著差異（如表2所示KPDA培養(yǎng)基和V8汁在2(TC全光照培養(yǎng) 下可使械菌刺抱產(chǎn)生分生抱子，但在試驗(yàn)中產(chǎn)抱量并不穩(wěn)定、可重復(fù)性差，產(chǎn)抱時(shí)間具有較 強(qiáng)的隨機(jī)性、周期長(zhǎng)(如表3所示）。因此在人工培養(yǎng)基使械菌刺抱產(chǎn)抱的方法不可行，需要 進(jìn)行下一步的產(chǎn)抱試驗(yàn)探索。但基于此試驗(yàn)可知PDA和V8汁培養(yǎng)基為較好的產(chǎn)抱培養(yǎng)基，并 且通過(guò)顯微觀察可知分生抱子主要是由其中的厚垣抱子產(chǎn)生分生抱子梗發(fā)育而來(lái)的。而相 比V8汁的制作，PDA是一種制作非常簡(jiǎn)易方便的培養(yǎng)基，因此篩選出PDA培養(yǎng)基為最佳的械 菌刺抱菌落培養(yǎng)基。
[0040] 表1不同溫度對(duì)械菌刺抱菌絲生長(zhǎng)的影響
[0041]
[0042] 注：用SPSS17.0對(duì)不同溫度下械菌刺抱菌絲生長(zhǎng)速率進(jìn)行差異顯著性分析，不同 小寫(xiě)字母表示差異達(dá)顯著水平(P<〇.〇5，N=5)。
[0043] 表2不同光照條件對(duì)械菌刺抱菌絲生長(zhǎng)的影響
[0044]
[0045] 注：用SPSS17.0對(duì)不同光照條件下械菌刺抱菌絲生長(zhǎng)直徑進(jìn)行差異顯著性分析， 不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)顯著水平(P<〇.〇5，N=5)。
[0046] 表3在不同培養(yǎng)基上的械菌刺抱產(chǎn)生分生抱子情況
[0047]
[004引注:表中V'為可在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上可產(chǎn)生分生抱子；"一"為不能在對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基上產(chǎn) 生分生抱子。
[0049]原理說(shuō)明：械菌刺抱在全光照培養(yǎng)下，接種6d前的菌絲體中一般不產(chǎn)生厚垣抱子， 典型的械菌刺抱菌絲體大多可分泌色素而使培