一種極速獲得分生孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種極速獲得分生孢子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冬蟲夏草[Oph1cordycepssinensis (Berk.)G.H.Sunget et al.]是我國青藏高原特產(chǎn)的傳統(tǒng)名貴中藥材，它是冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科蝙蝠蛾屬昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。近年來，隨著冬蟲夏草營養(yǎng)及藥用價值認(rèn)識的普及，加之人們生活水平不斷提高，對冬蟲夏草的需求不斷增大，導(dǎo)致亂采濫挖不斷加劇，資源破壞越來越嚴(yán)重，致使冬蟲夏草資源銳減，人工培植冬蟲夏草勢在必行。由于現(xiàn)有技術(shù)存在幼蟲染菌率低或染菌后存活率低等問題，一直制約著人工培植冬蟲夏草規(guī)?；l(fā)展，多年的研究證實，中國被毛孢(H.sinensis)為冬蟲夏草菌的無性型，分生孢子作為中國被毛孢生活史中極為重要的一個環(huán)節(jié)，在冬蟲夏草侵染和形成過程中起著十分關(guān)鍵的作用，有研究表明采用中國被毛孢分生孢子來侵染蝙蝠蛾幼蟲能夠明顯提高侵染率。
[0003]目前，常用的獲得中國被毛孢分生孢子的方法有:固體發(fā)酵誘導(dǎo)和微循環(huán)產(chǎn)孢。
[0004]固體發(fā)酵誘導(dǎo)獲得分生孢子的周期較長，一般為60?90天，導(dǎo)致培養(yǎng)過程中的染菌幾率增加，且產(chǎn)量不穩(wěn)定，受限于中國被毛孢菌株類型及固體培養(yǎng)基的優(yōu)劣。
[0005]微循環(huán)產(chǎn)孢是真菌的孢子萌發(fā)后，不經(jīng)過(或僅有極微弱的)菌絲生長階段，直接從孢子上產(chǎn)生產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子。該方法產(chǎn)孢周期短多用于冬蟲夏草菌無性型的鑒定，莫明和等在期刊《菌物系統(tǒng)》2001年第4期發(fā)表的文章“冬蟲夏草的微循環(huán)產(chǎn)孢及其無性型的分離”中公開了在載玻片上加一滴薩氏培養(yǎng)基，將子囊孢子點接于培養(yǎng)基上進行微循環(huán)產(chǎn)孢，5天后產(chǎn)生分生孢子，根據(jù)分生孢子的顯微特征對其進行鑒定，作者認(rèn)為該方法簡便可靠，具有很好的實用性。肖巖巖等在期刊《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報》2011年38卷第1期發(fā)表的文章“冬蟲夏草子囊孢子及其無性型在培養(yǎng)過程中的形態(tài)學(xué)觀察”中將中國被毛孢分生孢子接入液體培養(yǎng)基，進行微循環(huán)產(chǎn)孢后，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)手段將分離到的菌株鑒定為中國被毛孢?？梢姡瑐鹘y(tǒng)的微循環(huán)產(chǎn)孢以培育出少量的分生孢子作為冬蟲夏草菌無性型的鑒定為目的，并不追求分生孢子的產(chǎn)量，未對微循環(huán)產(chǎn)孢的環(huán)境溫濕度和營養(yǎng)條件做深入的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種改良的微循環(huán)產(chǎn)孢的的方法，該方法不僅培養(yǎng)周期短、成本低，而且工藝穩(wěn)定、產(chǎn)率高，為成功侵染蝙蝠蛾幼蟲提供穩(wěn)定的分生孢子來源。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0008]—種極速獲得分生孢子的方法，將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，分別置于墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在溫度12?18°C，相對濕度60?90%，避光的無菌環(huán)境下培養(yǎng)24?96h，即得中國被毛孢分生孢子。對蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅表面進行洗脫，收集分生孢子。
[0009]—些實施例中，本發(fā)明所述的中國被毛孢子囊孢子溶液，包含具有保濕和粘附作用的溶劑，優(yōu)選的為2?5 %甘油水溶液。
[0010]一些實施例中，本發(fā)明所述的中國被毛孢子囊孢子溶液，孢子的濃度為4500?5500個/ml，優(yōu)選的為5000個/ml。
[0011]—些實施例中，本發(fā)明所述的將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，涂抹工具為柔性工具，不損傷幼蟲，柔性工具可以是毛筆、布條、棉簽等，優(yōu)選的為毛筆。
[0012]—些實施例中，本發(fā)明所述的將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，每個載體的涂抹量為15?25μ1，優(yōu)選的為20μ1。
[0013]—些實施例中，本發(fā)明所述的將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，蝙蝠蛾幼蟲優(yōu)選的為3?5齡的活的幼蟲。
[0014]—些實施例中，本發(fā)明所述的墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿，濾紙濕度控制為充分潤濕，滿盈但不溢出水分。每天檢查，根據(jù)濾紙的水分狀況進行補加水處理。
[0015]一些實施例中，本發(fā)明所述的培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)選的為溫度14?16°C，相對濕度65?85%，避光的無菌環(huán)境。
[0016]—些實施例中，本發(fā)明所述的對蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅表面進行洗脫，洗脫液優(yōu)選的為含0.1 %吐溫80的0.003mol/l KH2P04緩沖液。
[0017]分生孢子在熒光顯微鏡下會產(chǎn)生藍色熒光，可使用熒光顯微鏡實時監(jiān)測產(chǎn)孢情況，于分生孢子量較大時進行收集，優(yōu)選在涂抹后的24?96h產(chǎn)生大量分生孢子。
[0018]本發(fā)明的子囊孢子可以為野生新鮮的冬蟲夏草彈射的子囊孢子，也可采集自人工培植的新鮮冬蟲夏草彈射的子囊孢子
[0019]由于微循環(huán)產(chǎn)孢產(chǎn)生分生孢子的數(shù)量少，此項技術(shù)多用于冬蟲夏草無性型的鑒定，中國被毛孢生長環(huán)境特殊，對人工誘導(dǎo)微循環(huán)產(chǎn)孢的營養(yǎng)和環(huán)境因素要求十分嚴(yán)格，申請人在對中國被毛孢生長特性長期深入研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動，提供了一種能夠獲得大量分生孢子的改良的微循環(huán)產(chǎn)孢的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案通過長新鮮的冬蟲夏草彈射的子囊孢子直接誘導(dǎo)分生孢子，未經(jīng)歷菌絲生長階段，產(chǎn)孢周期短，避免了在菌種分離和漫長的培養(yǎng)過程中存在的染菌或菌種性狀發(fā)生改變等問題。以蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅為培養(yǎng)基，在特定的環(huán)境條件控制下，能產(chǎn)生大量的分生孢子，在獲取中國被毛孢分生孢子領(lǐng)域具有突破性的進步。
【附圖說明】
[°02°]附圖1:焚光顯微鏡下蟲體與分生孢子
[0021]圖例:1蝙蝠蛾幼蟲體表剛毛2分生孢子
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明實施例公開了一種極速獲得分生孢子的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳的實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本發(fā)明所述方法進行改動或者適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0023]為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種極速獲得分生孢子的方法進行詳細(xì)說明。
[0024]本發(fā)明所用濾紙經(jīng)過預(yù)先高溫121°C，高壓30min滅菌處理。
[0025]實施例1
[0026]取新鮮收集的子囊孢子，用2%甘油