專利名稱：10億/克抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子顆粒劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物農(nóng)藥，具體涉及是制備含有抗苯并咪唑類殺菌劑微生物木霉孢 子顆粒劑及生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
木霉菌生長快，產(chǎn)孢量大，抑制多種植物病原菌，但對苯并咪唑類殺菌劑敏感，在 田間施用這類殺菌劑時不能發(fā)揮生物防治作用。目前單獨使用生防因子來控制作物病害， 往往受到環(huán)境條件等因素的干擾，造成田間防治效果不穩(wěn)定，由于對化學(xué)農(nóng)藥的敏感性問 題長期以來未能解決，使它們不能與化學(xué)農(nóng)藥同時應(yīng)用于植物病害的綜合防治。因此，為 解決生防菌應(yīng)用中所面臨的問題，實現(xiàn)化學(xué)農(nóng)藥與木霉菌的聯(lián)合使用，提高生防制劑的防 治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量及農(nóng)藥殘留。哈爾濱工業(yè)大學(xué)楊謙等采用基因工程的方 法，利用苯并咪唑類殺菌劑抗性基因改造木霉菌，獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的、具有對苯并咪唑
I^iilTsi (Min Li, Qian Yang. Isolationand characterization of a β -tubulin gene from Trichodermaharzianum. Biochemical genetics,2007,45 529-534.)，將苯并咪唑類殺菌劑抗性基因?qū)刖曛?，可以與苯并咪唑類殺菌劑同時應(yīng)用 于植物病害的綜合防治，有利于病害的防治和減少化學(xué)藥劑的使用量，有效地減少環(huán)境污 染。木霉菌劑型化有利于生產(chǎn)應(yīng)用及延長菌劑孢子的貨架期。目前急需解決的就是要研發(fā) 出高效、經(jīng)濟且具備商業(yè)化生產(chǎn)與化學(xué)殺菌劑同時使用的復(fù)合劑型，以提高菌株的生防效 果，解決當(dāng)今我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的迫切需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是制備一種具備商業(yè)化生產(chǎn)條件的高抗苯并咪唑類殺菌劑生防木霉， 將高抗苯并咪唑類殺菌劑生防木霉研制成能用于田間方便使用的顆粒劑型。本發(fā)明顆粒劑制備的工藝過程如下一、高抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子粉生產(chǎn)1、一級斜面培養(yǎng)將高抗苯并咪唑類殺菌劑木霉采用PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)6-7天。2、二級液體培養(yǎng)將上述培養(yǎng)物接種馬鈴薯葡萄糖糖基液體擴繁，振蕩培養(yǎng)24h，即作為固體發(fā)酵的 種子液。3、三級固體培養(yǎng)用開水浸泡低值陳米；然后放入高溫滅菌鍋滅菌；滅菌后待溫度降到25-30°C時， 將種子液接入低值陳米培養(yǎng)介質(zhì)中，放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12小時光照12小時黑暗交替培養(yǎng)， 保濕培養(yǎng)5天，培養(yǎng)至充分產(chǎn)孢即米粒上包裹一層淡綠色的孢子粉。4、孢子收集
將三級固體培養(yǎng)物，在30°C下通風(fēng)干燥48h后取出，采用封閉式真菌孢子分離器 收獲孢子粉，將孢子粉放在密閉容器里，在4°C低溫條件保存?zhèn)溆谩６?、顆粒劑及制備工藝1、顆粒劑本發(fā)明的顆粒劑的組分為，海藻酸鈉2-4%、硅藻土 5-8%、細米粉3-5%、抗苯并 咪唑類殺菌劑木霉分生孢子粉0.2% (孢子粉量占以上三組分和的百分比)以及由水補足 100%后組成；該顆粒劑是由海藻酸鈉固態(tài)高壓滅菌，其余成分硅藻土、細米粉和水取上述成分 比例拌均勻，高壓滅菌冷卻后，加入孢子粉攪拌成乳膠液，滴注入葡萄糖酸鈣溶液形成膠珠 硬化后制成。2、顆粒劑的制備工藝①將海藻酸鈉2-4 %固態(tài)高壓滅菌，其余成分硅藻土 5-8 %、細米粉3-5 %以及由 水補足100%后，加入攪拌器攪拌均勻，高壓滅菌；②將上述混合物滅菌后冷卻到30°C時，加入0. 2%的孢子粉(孢子粉量占海藻酸 鈉、硅藻土、細米粉三組分和的百分比)，攪拌均勻，即制成乳膠液。③將乳膠液放入滅菌滴注器內(nèi)滴注，使滴注的乳膠液落入0. IM高壓滅菌的葡萄 糖酸鈣溶液中，由于表面張力的作用，落入葡萄糖酸鈣溶液后呈球形，攪拌待膠珠硬化后濾
出ο④干燥后裝入包裝袋中，20°C以下溫度貯藏，貯藏期為一年。本發(fā)明優(yōu)點是生產(chǎn)工藝簡單、易于控制、成本低廉、是一種理想的防治植物土傳病 害生物農(nóng)藥，使用方法可以拌種穴施、苗床處理。同時具有持效期長，并有明顯的增產(chǎn)作 用，防效80%以上；對環(huán)境無污染、對人畜無害、投入低、易于商品化；使用量少，化學(xué)農(nóng)藥 殘留量低，價格適中等特點。保質(zhì)期一年。
具體實施例方式一、高抗苯并咪唑類殺菌劑分生孢子粉生產(chǎn)1、一級斜面培養(yǎng)將高抗苯并咪唑類殺菌劑木霉采用PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)6-7天。2、二級液體培養(yǎng)將上述培養(yǎng)物接種馬鈴薯葡萄糖糖基液體擴繁，振蕩培養(yǎng)(28 士 rC，200r/ min) 24h，作為固體發(fā)酵的種子液。3、三級固體培養(yǎng)用開水浸泡低值陳米，時間最佳值為8-10分鐘；然后放入高溫滅菌鍋滅菌，其滅 菌最佳溫度值為105°C、最佳時間值為8-10分鐘；待溫度降到25-30°C時，將種子液接入低 值陳米培養(yǎng)介質(zhì)中，其種子液與米的最佳比例為1 10，放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)，最佳溫度28°C， 12小時光照12小時黑暗交替培養(yǎng)，保濕培養(yǎng)5天，培養(yǎng)至充分產(chǎn)孢即米粒上包裹一層淡綠 色的孢子粉。4、孢子收集將三級固體培養(yǎng)物，在30°C下通風(fēng)干燥48h后取出，采用封閉式真菌孢子分離器MycoHarvester收孢機收獲孢子粉，在4°C低溫條件保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝滿足因地取材、成本低廉、簡便易行及質(zhì)量保證的原則，也能解 決企業(yè)生產(chǎn)中車間粉塵飄逸的要求。每公斤陳米可產(chǎn)40克孢子粉，故經(jīng)濟實用。該工藝生 產(chǎn)的孢子粉質(zhì)量達到微生物農(nóng)藥的企業(yè)生產(chǎn)標準，為進一步制劑加工提供保證。5、質(zhì)量檢測①含孢量的測定將0. 001克樣品加入50mL 0. 5% Tween 80溶液中，磁力攪拌30min，用血球計數(shù) 板測定孢子懸液濃度，計算樣品的含孢量，重復(fù)5次。②活孢率的測定將0. 001克樣品加入含2%蔗糖和0. 5%蛋白胨50mL萌發(fā)液中。將孢子液在28 士 l°c下振蕩(120r/min)培養(yǎng)20h，取樣用血球計數(shù)，重復(fù)5次。③水分的測定參照GB/T1600-2001共沸蒸餾法按此工藝生產(chǎn)木霉孢子粉，可獲得含孢量500億/克左右、含水量控制在5%以下 的孢子粉產(chǎn)品?；铈呗?0%以上。6、貯存將孢子粉放在密閉容器里，在4°C低溫條件保存?zhèn)溆?。二、顆粒劑制備工藝1、將海藻酸鈉2-4%固態(tài)高壓滅菌(最佳溫度值為121°C、最佳時間值為20分 鐘)，其它成分硅藻土 5-8 %、細米粉3-5 %以及由水補足100 %后加入攪拌器攪拌均勻高壓 滅菌(最佳溫度值為121°C、最佳時間值為20分鐘)；2、將上述混合物滅菌后冷卻到30°C時，加入0.2% (孢子粉量占海藻酸鈉、硅藻 土、細米粉三組分和的百分比)的孢子粉，攪拌均勻即制成乳膠液。3、將上述乳膠液放入孔口直徑最佳值為2mm的滅菌滴注器內(nèi)滴注，使滴注的乳膠 液落入0. IM高壓滅菌的葡萄糖酸鈣溶液中，顆粒由于表面張力的作用，落入葡萄糖酸鈣溶 液后呈球形，攪拌待膠珠硬化后濾出。4、干燥后裝入包裝袋中，20°C以下溫度貯藏，貯藏期為一年。5、質(zhì)量檢測將顆粒溶解在0. 087M磷酸二氫鉀和0. 03M磷酸氫二鈉混合溶液中，在PDA培養(yǎng)基 上培養(yǎng)估測孢子萌發(fā)率，萌發(fā)率為80. 5%。生產(chǎn)應(yīng)用本發(fā)明的顆粒劑與苯并咪唑類殺菌劑多菌靈(1 1比例)混合應(yīng)用于植物病害 的綜合防治，有利于病害的防治和減少化學(xué)藥劑的使用量，有效地減少環(huán)境污染。經(jīng)田間試 驗，對瓜類枯萎病、水稻立枯病、番茄幼苗的猝倒病等多種土傳病害有較好的防治效果，其 防治效果80%以上，還有提高植物的抗逆性、促進植物生長的作用。其使用方法為本發(fā)明的 顆粒劑與苯并咪唑類殺菌劑多菌靈以1 1混合，穴施，用量為0.5-1. 0克/穴。
權(quán)利要求
一種10億/克抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子顆粒劑，其特征是其顆粒劑的組分為，海藻酸鈉2 4％、硅藻土5 8％、細米粉3 5％、抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子粉0.2％(孢子粉量占以上三組分和的百分比)以及由水補足100％；顆粒劑是由海藻酸鈉固態(tài)高壓滅菌，其余成分硅藻土、細米粉和水按上述比例攪拌均勻，高壓滅菌冷卻后，加入孢子粉攪拌成乳膠液，滴注入葡萄糖酸鈣溶液形成膠珠，硬化后制成。
2.一種制造權(quán)利要求1的顆粒劑制備工藝，其特征是①將海藻酸鈉2-4%固態(tài)高壓滅菌，其余成分硅藻土5-8%、細米粉3-5%以及由水補 足100%后，加入攪拌器攪拌均勻，高壓滅菌；②將上述混合物滅菌后冷卻到30°C時，加入0.2%的孢子粉(孢子粉量占海藻酸鈉、硅 藻土、細米粉三組分和的百分比)，攪拌均勻，即制成乳膠液；③將乳膠液放入滅菌滴注器內(nèi)滴注，使滴注的乳膠液落入0.IM高壓滅菌的葡萄糖酸 鈣溶液中，由于表面張力的作用，落入葡萄糖酸鈣溶液后呈球形，攪拌待膠珠硬化后濾出；④干燥后裝入包裝袋中，20°C以下溫度貯藏，貯藏期為一年。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的顆粒劑制備工藝，其特征是所述的固態(tài)高壓滅菌以及 高壓滅菌，其滅菌的最佳溫度值為121°C，最佳時間值為20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的顆粒劑制備工藝，其特征是在步驟③中所述的將乳膠液放 入滅菌滴注器內(nèi)滴注，其滴注器孔口直徑最佳值為2mm。
5.一種10億/克抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子粉的制備方法，其特征是高抗苯 并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子粉生產(chǎn)工藝如下①一級斜面培養(yǎng)將高抗苯并咪唑類殺菌劑木霉采用PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)6-7天；②二級液體培養(yǎng)將上述培養(yǎng)物接種馬鈴薯葡萄糖糖基液體擴繁，振蕩培養(yǎng)24h，即作為固體發(fā)酵的種子液；③三級固體培養(yǎng)用開水浸泡低值陳米；然后放入高溫滅菌鍋滅菌，滅菌后待溫度降到25-30°C時，將種 子液接入低值陳米培養(yǎng)介質(zhì)中；放到培養(yǎng)箱培養(yǎng)，12小時光照12小時黑暗交替培養(yǎng)，保濕 培養(yǎng)5天，培養(yǎng)至充分產(chǎn)孢即米粒上包裹一層淡綠色的孢子粉；④孢子收集將三級固體培養(yǎng)物，在30°C下通風(fēng)干燥48h后取出，采用封閉式真菌孢子分離器收獲 孢子粉，將孢子粉放在密閉容器里，在4°C低溫條件保存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的木霉分生孢子粉的制備方法，其特征是在步驟②中所述 的，將上述培養(yǎng)物接種馬鈴薯葡萄糖糖基液體擴繁，振蕩培養(yǎng)24h，其最佳振蕩環(huán)境參數(shù)為 28 士 l°C，200r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的木霉分生孢子粉的制備方法，其特征是在步驟③中所述的， 用開水浸泡低值陳米，時間最佳值為8-10分鐘；在高溫滅菌鍋滅菌，其滅菌的最佳溫度值 為105°C，最佳時間值為8-10分鐘；其種子液與米的最佳比例為1 10;培養(yǎng)箱培養(yǎng)，最佳 溫度28 °C。
8. —種權(quán)利要求1、2所述的抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子顆粒劑應(yīng)用方法，其特 征是本發(fā)明的顆粒劑與苯并咪唑類殺菌劑多菌靈按1 1的比例混合應(yīng)用于植物病害的 綜合防治，可進行穴施，用量為0. 5-1. 0克/穴。
全文摘要
10億/克抗苯并咪唑類殺菌劑木霉分生孢子顆粒劑及制備方法，本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，實現(xiàn)高抗苯并咪唑類殺菌劑生防木霉商業(yè)化生產(chǎn)，其技術(shù)內(nèi)容分為1、分生孢子粉制備；2、木霉菌分生孢子顆粒劑及生產(chǎn)工藝；3、該劑型與苯并咪唑類殺菌劑聯(lián)合應(yīng)用于植物病害的綜合防治方法。本發(fā)明顆粒劑有利于病害的防治和減少化學(xué)藥劑的使用量。在對多種大田作物及蔬菜的立枯病、猝倒病、枯萎病等土傳病害的防治試驗中，其防治效果80％以上；對環(huán)境無污染、對人畜無害；投入低、易于商品化；使用方便、貨架期長，保質(zhì)期一年其孢子萌發(fā)率80％以上；同時具有持效期長，并有明顯的增產(chǎn)作用，使用量少，化學(xué)農(nóng)藥殘留量低，價格適中等特點。
文檔編號A01N25/12GK101889585SQ201010205608
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者周傳余, 宋金柱, 張金棟, 楊謙 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)