活力的影響。
[0106] 如圖9所示，隨著抑值的增大，游離酶和固定化酶活性均呈現(xiàn)先增大而后減小的變 化趨勢，最適抑值均是4.8，但是固定化纖維素酶在大部分的抑值下都比游離的纖維素酶活 性高，運表明固定化纖維素酶較游離纖維素酶表現(xiàn)出更好的pH適應性。
[0107] 實驗 3-2
[0108] 對應取適量的游離酶和固定化酶，加入HAc-化Ac緩沖液和CMC-化溶液，分別于30 °c、4〇°c、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc條件下反應，按照游離酶活力測定方法和固定化酶活力測 定方法測定酶活力，最高的酶活力設為100 %。
[0109] 圖10為溫度對游離酶和固定化酶相對活力的影響。
[0110] 如圖10所示，游離酶的最適溫度為50°C，且曲線走向趨勢較為睹峭，說明游離酶的 催化反應受溫度影響較大，而經(jīng)固定化后，雖然固定化酶的最適溫度沒有提高，但是在50 °C-7(TC范圍內都保持了較高的酶活，最適溫度范圍變寬。運說明固定化酶的熱穩(wěn)定性要 高于游離酶。
[0111] 實驗 3-3
[0112] 對應取適量的游離酶和固定化酶，置于50和70°C水浴中，每隔30min、60min、 90min、120min取出測定酶活力，未經(jīng)保溫處理的酶活設定為100%。
[0113] 圖11為50°C下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性。圖12為70°C下游離酶和固定化酶的 熱穩(wěn)定性。
[0114] 如圖11所示，在50°C時，隨著保溫時間的延長，游離酶和固定化酶的酶活力出現(xiàn)不 同程度的降低，且游離酶活力下降的更快。保溫120min后，游離酶和固定化酶殘留活力為 64 %、65 % (MCTS)和68 % (MCTS-TAP)。由圖12可W得出，在70°C時，游離酶和固定化酶的酶 活力也會隨著保溫時間的延長而降低，且和50°C時比較，其降低速率更快。保溫90min時，游 離酶活力只有55%，固定化酶活力在60% W上，保溫120min時，游離酶活力僅剩余41%，固 定化酶殘存活力為45% (MCTS)和48% (MCTS-TAP)。由此可得出，固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯 優(yōu)于游離酶，運對固定化酶在工業(yè)上的應用具有重要的意義。
[0115] 實驗 3-4
[0116] 精確配制幾份具有濃度梯度的簇甲基纖維素鋼溶液。在某個濃度，間隔一定的時 間測定酶的活力，因而可W測得該濃度下酶的反應速度。依此法測得各濃度下酶的反應速 度，最后根據(jù)Lineweaver-Burk作1 /v對1 /[ S]的雙倒數(shù)圖，求Km值。
[0117] 米氏方程(Michaelis-Menten equation)，表明了反應底物濃度酶促反應速度之 間的定量關系。Mi chae 1 i S-Ment en方程的數(shù)學表達式如下：
[011 引
[0119] 式中V為反應速度(iig/mL ? 111111)，1(。為米氏常數(shù)(111肖/1111^;￥。3、為酶反應的最大速度 (iig/mL-min)，[S]是底物濃度。
[0120] 游離酶和固定化酶的動力學參數(shù)(Vmax和Km)采用雙倒數(shù)作圖法化ineweaver-Burk 作圖法)求得。Lineweaver-Burk方程的數(shù)學表達式如下：
[0121]
[0122] 圖13為固定化酶和游離酶的Lincwaver-Burk曲線。
[0123] 由圖13可W得游離纖維素酶和固定化纖維素酶的米氏方程，分別為：
[0124] 游離纖維素酶的米氏方程：
[0125] y = 0.0151x+0.8501，r2 = 0.9950
[0126] 采用MCTS為載體的固定化纖維素酶的米氏方程：
[0127] Y = 0.0 201X+0.5537，r2 = 0.9967
[0128] 采用MCTS-TAP為載體的固定化纖維素酶的米氏方程：
[0129] y = 0.0186x+0.6209，r2 = 0.9918
[0130] 由W上方程可W計算出游離纖維素酶和四種固定化纖維素酶的米氏常數(shù)Km分別 為:游離纖維素酶0. 〇18mg/mM固定化纖維素酶(MCTS)0.036mg/mL固定化纖維素酶(MCTS- TAP)0.030mg/mL〇
[0131] Km表示酶與底物親和力的大小，一般近似用1/Km表示親和力。Km值越小，1/Km值越 大，表明酶和底物的親和力越大，酶促反應易于進行。從上可W看出，游離纖維素酶的Km值 最小，固定化酶的Km值較大。即固定化酶與底物的親和力降低。
[0132] 實驗 3-5
[0133] 將多份游離酶和固定化酶置于4°C冰箱保存，每隔7天取出測酶活力，監(jiān)測酶活的 降低趨勢，直至35天。
[0134] 圖14為游離酶和固定化酶的膽藏穩(wěn)定性。
[0135] 如圖14所示，游離纖維素酶和固定化酶的酶活力都逐漸下降，但幅度各不相同。游 離酶隨著膽藏時間的延長，酶活力下降很快，到35天時，其剩余活力僅剩下20%。而固定化 酶的活性在35天時在50% W上。結果表明，經(jīng)固定化后纖維素酶的穩(wěn)定性得到有效的提升。 固定化酶具有比游離酶更好的膽藏穩(wěn)定性，運在實際應用和生產(chǎn)中具有非常重要的意義。
[0136] 實驗 3-6
[0137] 取固定化纖維素酶加入5mL HAc-化Ac緩沖液和濃度為1 %CMC-Na溶液，于50°C反 應30min后，測定酶活力并過濾分離固定化酶，用PBS緩沖液洗涂。在相同條件下重復W上步 驟并測定相應的酶活，得重復反應9次的固定化酶，第一次反應測量的酶活設為100%。
[0138] 圖15為固定化纖維素酶的重復使用性能。
[0139] 如圖15所示，固定化纖維素酶的活性則隨著操作次數(shù)的增加而緩慢下降，固定化 酶在經(jīng)過5次的重復使用后，活性可保留80% W上，使用9次W后，MCTS和MCTS-TAP固定化酶 活性保留在50% W上。由于固定化酶較游離酶可W進行多次重復使用，且具有操作穩(wěn)定性， 不僅提高了酶的使用效率，有效地降低成本，也使連續(xù)催化反應工藝設計成為可能，具有實 際應用價值。
[0140] 上述實施例不W任何方式限制本發(fā)明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得 的技術方案均落在本發(fā)明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球的制備方法，其特征在于，包括： (1) 在0.5g殼聚糖粉末和0.125g納米四氧化三鐵中加入質量分數(shù)為4%的乙酸溶液，待 殼聚糖粉末充分溶解后，加入液體石蠟，250r/min轉速下攪拌10分鐘； (2) 將步驟（1)的所得物升溫至50°C，滴加乳化劑Span80，乳化10分鐘； (3) 在步驟(2)的所得物中加入l.OmL的甲醛溶液，攪拌反應1.5小時； (4) 將步驟(3)的所得物升溫至70°C，滴加質量分數(shù)為10%的NaOH溶液，在溶液pH值保持 為堿性條件下，緩慢滴加2. OmL的環(huán)氧氯丙烷，反應5小時； (5) 將步驟(4)的所得物過濾，用蒸餾水洗滌，再依次用石油醚、無水乙醇洗滌、水洗滌， 直至洗滌液的pH值達到中性； (6 )將50mg步驟(5 )的所得物加入50mL反應溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中浸泡； (7 )在步驟(6 )的所得物中加入200mgTAP及催化劑，在氮氣保護條件下于100 °C下攪拌 反應12小時； (8)將步驟(7)的所得物用反應溶劑浸泡洗滌至洗滌液為無色，再依次用蒸餾水、無水 乙醇洗滌后，干燥至恒重，得到用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球(MCTS-TAP)。2. -種用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球，其特征在于，由權利要求1所述的方法制 備。3. -種纖維素酶固定化的方法，其特征在于，包括： (1) 將10mg權利要求2所述的改性磁性殼聚糖微球用pH值為4.0~7.0的10mL的磷酸緩 沖液溶脹24小時后分離； (2) 在步驟（1)的所得物中加入10mL的5%戊二醛溶液，于25 °C下振蕩活化5小時并過濾， 用蒸餾水洗去多余的戊二醛； (3 )在步驟(2 )的所得物中加入1.5mg酶液，于25~30 °C下恒溫振蕩固定2~6小時后，過 濾，濾渣用磷酸緩沖液進行反復沖洗后得固定化酶。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(3)中固定時間為5小時。5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(1)中磷酸緩沖液的pH值為7.0。6. 如權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(3)中固定溫度為30°C。7. -種由權利要求3至6任意一項所述的纖維素酶固定化方法得到的固定化酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球、其制備方法及應用，上述制備方法包括：在0.5g殼聚糖粉末和0.125g納米四氧化三鐵中加入質量分數(shù)為4%的乙酸溶液，充分溶解后，加入液體石蠟，250r/min轉速下攪拌10分鐘；升溫至50℃，滴加乳化劑Span80，乳化10分鐘；加入1.0mL的甲醛溶液，攪拌反應1.5小時；升溫至70℃，滴加質量分數(shù)為10%的NaOH溶液，緩慢滴加2.0mL的環(huán)氧氯丙烷，反應5小時；過濾洗滌，得到磁性殼聚糖微球（MCTS）；將50mg MCTS加入50mL DMF浸泡；加入200mgTAP，在氮氣保護條件下于100℃下攪拌反應12小時；用反應溶劑浸泡洗滌至洗滌液為無色，再依次用蒸餾水、無水乙醇洗滌后，干燥至恒重，得到用于酶固定化的改性磁性殼聚糖微球（MCTS-TAP）。本發(fā)明能夠提供固定化酶的良好載體。
【IPC分類】C08B37/08, C12N11/10, C12N11/14, C08J3/03
【公開號】CN105695442
【申請?zhí)枴緾N201510874083
【發(fā)明人】熊春華, 繆喜喜, 皮蕾蕾, 李建丹, 阮璟悅
【申請人】浙江工商大學
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2015年12月2日