062] 用十萬分之一的精密電子天平準確稱重，用雙面膠將包好的樣品貼在石英樣品桿 端，固定在VSM的振動頭上，測試樣品的靜磁參數(shù)隨磁場的變化。測試條件：環(huán)境溫度為 298K，測試角度0.00°。
[0063] 圖1及圖2分別為Fe3〇4、磁性殼聚糖、2,4,6-改性磁性殼聚糖微球的磁化曲線。 Fe3〇4、MCTS和 MCTS-TAP 的飽和磁化強度分別為 56.8emu/g、9.76emu/g 和6.63emu/g。兩種磁 性微球的飽和磁力強度均小于化3化的強度，因為在合成磁性殼聚糖微球時，F(xiàn)e3化的比例較 小，合成改性磁性殼聚糖微球時，配體的成功引入也會降低化3化的比例。磁滯回線不存在明 顯的滯后性，為S型磁化曲線，幾乎無磁滯現(xiàn)象，說明兩種磁性殼聚糖微球具有良好的超順 磁性。磁性微球在使用過程中易于在外加磁場作用下分離，運對于固定化酶的回收利用極 其重要。
[0064] 實驗 1-3
[0065] 取適量充分干燥后的樣品，使用梅特勒TGA/DSC1型同步熱分析儀進行熱重分析。 分析條件:載氣:化;載氣流量:20血/min;升溫程序:20°C/min，起止溫度:化°C-1000°C。
[0066] 圖3是磁性殼聚糖微球(MCTS)、2,4,6-S氨基喀晚（TAP)和改性磁性殼聚糖微球 (MCTS-TAP)的熱重分析圖。磁性殼聚糖微球的失重主要分為兩個階段，第一階段為25-150 °C，主要是水分的散失，失重率為4.3%，第二階段為220-400°(：，主要是殼聚糖分子熱分解， 失重率為49.2%。2，4，6-S氨基喀晚在250-350°C內(nèi)失重加劇，失重率為77.2%，450°C后分 解減緩，850°C時分解完全。MCTS-TAP在200-350°C失重現(xiàn)象明顯，失重率為44.1 %，溫度在 400°C之后MCTS-TAP與TAP失重曲線基本相似，并最終緩慢趨于平衡，但其分解溫度卻高于 TAP,說明母體與功能基結(jié)合的化學鍵較為牢固，增加了微球的熱穩(wěn)定性。
[0067] 實施例2
[0068] (1)準確稱取IOmg的改性磁性殼聚糖微球載體，用IOmL的憐酸緩沖液(PBS，抑=7) 溶脹24小時后分離；
[0069] (2)在步驟(1)的所得物中加入IOmL的5%戊二醒溶液，于25°C下振蕩活化5小時并 過濾，用蒸饋水洗去多余的戊二醒；
[0070] (3)在步驟(2)的所得物中加入2.Omg的纖維素酶酶液，30°C恒溫振蕩固定5小時 后，過濾，濾渣用憐酸緩沖液進行反復沖洗后得固定化酶，將得到的固定化酶置于冰箱中 保存(4°C)備用。
[0071] W下說明纖維素酶活力的測定方法及由實施例2得到的固定化酶的酶活力測定方 法。
[0072] 游離酶活力測定：取適量纖維素酶溶于HAc-化Ac緩沖液，配置成一定濃度的纖維 素酶溶液。取ImL酶液加入SmLHAc-化Ac緩沖液，再加入IOmL濃度為1 %簇甲基纖維素鋼 (CMC-Na)溶液，并做平行。對照組的酶液在沸水中滅活15min，空白組中不加催化底物，用等 量的HAc-化Ac緩沖液替代。在50°C振蕩器中W15化/min反應30min，立即取2mL反應液與比 色管中，加入2mLDNS試劑，混勻后于沸水中加熱1 Om i n后用流水冷卻，定容至2 5mL，搖勻后靜 置15min，用空白調(diào)零點，于540nm處測定吸光度，并計算纖維素酶的活力。
[0073] 固定化酶活力測定：取等當量的固定化酶加入5mL HAc-化Ac緩沖液，再加入IOmL 濃度為1 %簇甲基纖維素鋼(CMC-Na)溶液，在50°C振蕩器中W12化/min反應30分鐘，立即取 2mL反應液于比色管中，加入2mL DNS試劑，混勻后于沸水中加熱10分鐘后用流水冷卻，定容 至25mL，搖勻后靜置15分鐘，于540nm處測定吸光度，并計算纖維素酶的活力。同樣設置平行 和對照。
[0074] A A=A^r 細為
[0075]
[0076] 其中：A平均:樣品液的平均吸光值;A礎,?:對照液的吸光值;G: A A值在葡萄糖標準曲 線上對應的葡萄糖量;n:酶粉(液)的稀釋倍數(shù);t:反應時間樣品重量(mg)。
[0077] 固定化酶的活力回收率是指固定化酶總活力與固定化時加入游離酶總活力的比 值，W百分數(shù)表示。
[007引
[0079]固定化酶或游離酶的相對酶活（％):指在同組實驗中W活力最高的為100,與其余 的固定化酶或游離酶的活力之比，通常W百分數(shù)表示。
[0080] 其中，上述提及的葡萄糖標準曲線的制作如下：
[0081] 取11支比色管，洗凈烘干并編號，按表巧日入l.Omg/mL葡萄糖標準溶液和蒸饋水， 配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。
[0082] 表2不同濃度的葡萄糖溶液
[0083]
[0084] 將溶液搖勻后，向各比色管中加入2.OmL DNS，搖勻后在沸水浴中加熱lOmin，然后 流水冷卻，用蒸饋水定容至25mL，充分搖勻后靜置15min，Wo號試管為參比，于540皿處測吸 光度。W葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值A540為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。如圖4所示，得到 的線性方程為y = 1.1895X-0.0007(r2 = 0.9996)。
[0085] 實驗 2-1
[0086] 平行取各類微球載體10.Omg多份，在其它固定化條件相同的情況下，改變固定化 時間分別為2小時、3小時、4小時、5小時、6小時，然后在其它固定化條件相同的情況下，按照 實施例2的方法制備固定化酶。
[0087] 圖5為時間對纖維素酶固定化的影響。
[00則如圖5所示，固定化時間對酶活力有很大影響。MCTS和MCTS-TAP載體固定化酶的相 對活力均隨時間的延長而增大，MCTS和MCTS-TAP載體固定化酶的相對活力在5小時達到最 大，此后隨著時間的繼續(xù)增加，相對酶活呈現(xiàn)下降的趨勢。若時間太短，酶分子與載體不能 進行充分的接觸固定，導致固定于載體上的酶分子較少，固定化酶活力低;若時間過長，載 體上經(jīng)過戊二醒活化產(chǎn)生的與酶結(jié)合的位點趨于飽和，酶分子在載體上積聚過多，導致空 間位阻的增大，影響酶和底物的有效接觸，W及底物的擴散作用，影響酶分子活力的發(fā)揮。 另外，固定化是在振蕩條件下進行，過長的時間也可能使載體表面結(jié)合不牢的酶蛋白脫落 下來，運也會導致酶活性的下降。因此，MCTS和MCTS-TAP載體對纖維素酶的固定化時間為5 小時。
[0089] 實驗 2-2
[0090] 用不同抑的緩沖液(抑=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)配置一系列濃度為0.1111旨/血的纖 維素酶溶液，并分別測定不同抑值下的游離酶活力，再平行取殼聚糖微球載體10.Omg多份， 在其它固定化條件不變的情況下，分別加入20mL上述不同抑值的纖維素酶溶液，然后在其 它固定化條件相同的情況下按照實施例2的方法制備固定化酶。
[0091 ]圖6為pH值對纖維素酶固定化的影響。
[0092] 如圖6所示，當pH在6.0-7.0范圍時，MCTS和MCTS-TAP載體固定化酶均表現(xiàn)出較高 的活性，超出此范圍，酶活力均出現(xiàn)不同程度的下降。由于pH值對纖維素酶的活性中屯、和結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定性W及酶與載體的結(jié)合具有影響，固定化酶的形成最好在中性(pH=7.0)或偏中性 條件下進行，過酸或者過堿的pH環(huán)境都會降低酶的活力。
[0093] 實驗 2-3
[0094] 平行取殼聚糖微球載體10.Omg多份，在其它固定化條件相同的情況下，分別加入 不同量的纖維素酶，使給酶量為1.0/10.0 mg載體、1.5/10.0 mg載體、2.0/10.0 mg載體、2.5/ 10.0 mg載體和3. Omg/10.0 mg載體，然后在其它固定化條件相同的情況下按照實施例2的方 法制備固定化酶。
[00%]圖7為給酶量對纖維素酶固定化的影響。
[0096] 如圖7所示，殼聚糖微球載體質(zhì)量一定，固定化酶的活力隨著給酶量的增加而變 大，當給酶量增加到一定值時，酶活力反而有所降低。由圖7可知給酶量在2.0-2.5mg/ 10.0 mg (MCTS-TAP載體)和1.5-2. Omg/10.0 mg (MCTS載體）范圍內(nèi)，固定化酶均具有較高的酶 活力。
[0097] 實驗 2-4
[0098] 平行取殼聚糖微球載體10.Omg多份，在其它固定化條件相同的情況下，改變固定 化溫度分別為15°(：、20°(：、25°(：、30°(：和35°(：，然后在其它固定化條件相同的情況下按照實 施例2的方法制備固定化酶，觀察溫度對酶固定化的影響。
[0099] 圖8為溫度對纖維素酶固定化的影響。
[0100] 如圖8所示，相對酶活隨固定化溫度的升高呈現(xiàn)出先增加而后減小的趨勢。當固定 化溫度在25-35°C范圍時，固定化纖維素酶的相對活力均達到了78% W上。
[0101] 綜上，磁性殼聚糖微球載體MCTS固定化酶的最佳條件：固定化時間化，固定化抑= 7，給酶量為1.5mg/10.0 mg載體，固定化溫度為30°C。在此最佳固定化條件下，酶的固載量為 73.5mg/g(載體），酶活力回收率達到了 71.6 %。
[0102] 2，4，6-S氨基喀晚改性磁性殼聚糖微球載體MCTS-TAP固定化酶的最佳條件：固定 化時間化，固定化抑7，給酶量為2.Omg/10.0 mg載體，固定化溫度為30°C。在此最佳固定化條 件下，酶的固載量為94.4mg/g (載體），酶活力回收率達到了 80.3 %。
[0103] 實驗 3-1
[0104] 對應取適量的游離酶和固定化酶，分別加入不同抑(2.8-7.8)的HAc-化Ac緩沖液 和對應pH值的CMC-化溶液，按照游離酶活力測定方法和固定化酶活力測定方法測定酶活 力，最高的酶活力設為100 %。
[0105]圖9為抑對游離酶(Free enzyme)和固定化酶相對