密度接種于96孔板中，邊緣孔 用PBS填充，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基不接種細(xì)胞，置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中解育 化后，加 TNF-a(lOng/ml)刺激，置于37°C、5 %C〇2培養(yǎng)箱中解育24h后，空白對照組加等體積 的培養(yǎng)基，藥物組加入等體積不同濃度的提取物（藥物終濃度為25、50、100、200、400iig/ mU，置于37°C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中解育24h后，吸棄培養(yǎng)基，藥物組加入等體積不同濃度的藥 物，空白對照組加等體積的培養(yǎng)基，置于37°C、5 %C〇2培養(yǎng)箱中繼續(xù)解育24h后每孔加入IOii 1 CCK-8，置于37 °C、5 % C〇2培養(yǎng)箱中解育化后，震蕩數(shù)分鐘后用酶標(biāo)儀測定450nm處各孔的 吸光度值，計(jì)算抑制率及IC50值。結(jié)果如表1所示。
[0050] 表1不同提取方法所得提取物對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖抑制作用
[0化1 ]
[0052] 綜上，95%乙醇提取物化1)和70%乙醇提取物化2)的對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖抑制 作用較強(qiáng)，后續(xù)試驗(yàn)采用90%醇提的方法對澤漆進(jìn)行提取。
[0053] 實(shí)施例2澤漆抗銀屑病有效部位的篩選
[0054] 取適量澤漆藥材100g，90%乙醇回流提取2~3次，合并提取液，過濾，減壓蒸干溶 劑得澤漆浸膏。將浸膏分散于一定量的水中，形成混懸液，依次用石油酸、氯仿、乙酸乙醋、 正下醇按體積比1:1對浸膏進(jìn)行萃取，每種溶劑萃取=次，合并萃取液，減壓蒸干溶劑，即得 澤漆的石油酸部位(Fra)，氯仿部位(Frb)，乙酸乙醋部位(FrC),正下醇部位(Frd)。
[0055] 對W上部位進(jìn)行體外抗銀屑病活性篩選，結(jié)果如表2所示。
[0056] 表2澤漆提取物不同部位對角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖抑制作用 [0化7]
[0058] 綜上，澤漆的石油酸(Fra)和氯仿(Frb)萃取部分對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖抑制 作用較強(qiáng)。由此推測澤漆抗銀屑病的有效部位可能為Fra和Frb。
[0059] 實(shí)施例3澤漆提取物抗銀屑病有效部位的制備
[0060] 取澤漆陰干藥材15kg，倒入提取罐，力的0 %的乙醇水溶液60~80L，回流提取4次， 每次2地，合并4次所得乙醇提取液，過濾。乙醇提取液減壓蒸饋回收乙醇后的澤漆總提物浸 膏。加水混懸后，依次用等體積石油酸、氯仿反復(fù)萃取=次，合并萃取液，減壓蒸干溶劑得石 油酸部位Fra(ISOg)，該部位為黑色半固體制劑?？杉尤胂鄳?yīng)的輔料制成乳膏劑。氯仿部位 化b(210g)，該部位為深棟色半固體制劑，可加入相應(yīng)的輔料制成乳膏劑。
[0061 ]實(shí)施例4有效部位部位化學(xué)成分的研究
[0062] 材料與試劑：
[0063] AM-300、400，DRX-500型核磁共振光譜儀（瑞:t化Uker公司，四甲基硅烷作為內(nèi) 標(biāo)）；Sephadex LH-20(瑞典GEHealthcare Bio-Sciences公司）；MCI小孔樹脂（日本 Mitsubishi 化emical公司）；十八烷基鍵和硅膠（octadecyIsiIyl ,ODS，日本F'ujisiIysia 化emical公司）；硅膠(青島海洋化工廠）；薄層色譜GF254硅膠板板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限 公司）；気代試劑（美國Sigma-al化ich公司）；甲醇、乙醇、氯仿、丙酬、石油酸等化學(xué)試劑均 為分析純。
[0064] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0065] 石油酸部位Fra(120g)經(jīng)硅膠柱色譜(石油酸-乙酸乙醋50:1~0:1)梯度洗脫得到 8個部分，F(xiàn)ra-I~Fra-8 oFra-4經(jīng)過Se地adex LH-20(石油酸-氯仿-甲醇10:10:1)、中低壓柱 色譜(石油酸-丙酬20:1)、反復(fù)硅膠柱色譜W及重結(jié)晶的方法進(jìn)一步分離和純化，得到化合 物l(277mg)，10(55mg)，2a35mg)。Fra-4中低壓柱色譜、SephadexLH-20、反復(fù)硅膠柱色譜 分離得到化合物13(34mg)，15(8mg)，16/17(12mg)，F(xiàn)ra-6經(jīng)中低壓柱色譜用油酸-丙酬15: 1)得到6個部分，片a-6-l~片日-6-6。片日-6-2經(jīng)S邱hadex LH-20、反復(fù)硅膠柱色譜，得到化合 物11 (34mg)，14 (45mg)。Fra-6-6經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜得到化合物12 (28mg)。
[0066] 氯仿部位Frb(250g)經(jīng)硅膠柱色譜(石油酸-丙酬60:1~0:1)梯度洗脫得到9個部 分，F(xiàn)rb-I~Frb-9。村3-5經(jīng)硅膠柱(石油酸-丙酬10:1~0:1)得到5個部分，F(xiàn)rb-5-l~Frb-5- 5，其中Frb-5-3經(jīng)S邱hadex LH-20 (純乙醇），硅膠柱，ODS-Cis柱色譜進(jìn)一步分離純化，得到 化合物S(IOmg) Jrb-S經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇50:1~0:1)得到8個部分，F(xiàn)rb-8-l~Frb-8-9cFrb-8-3經(jīng)S邱hadex LH-20(30%~100%甲醇）、MCI (0~100%甲醇）W及反復(fù)硅膠柱色 譜得到化合物9(Smg) nFrb-8-3經(jīng)S邱hadex LH-20(30 % ~100% 甲醇）、MCI (0~100 % 甲醇） ^及反復(fù)硅膠柱色譜得到化合物3(25111旨），7(15111旨）。村3-8-8經(jīng)56911日(16《1^1-20(30%~ 100%甲醇）、1(：1(0~100%甲醇）^及反復(fù)硅膠柱色譜得到化合物6(23111邑），5(15111邑），4 (31mg)。
[0067] 化合物結(jié)構(gòu)鑒定：
[0068] 通過波譜學(xué)技術(shù)（1護(hù)匪3，1化-匪1?，^及20-匪1〇進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定為正^^^一燒醇 (1)、護(hù)谷醬醇(2)、金色酷胺醇脂(3)、搬皮素(4)、5-徑基-6,7-二甲氧基黃酬巧）、山奈酪香 豆酷基葡萄化喃糖巧(6)、抽皮素(7)、異嗦皮晚(8)、松脂素(9)、14a，150-二乙酷氧基-3a，7 (6-二苯甲酯基-9-氧代-20，13a-麻風(fēng)樹-5E，1IE-二締（10)、euphoscopin B( 11)，大戟巧I (12)，1雌611〇1(13)，大戟巧11(14)7日-徑基谷醬醇（15)(241?/5)-環(huán)阿屯-25-締-30，24-二醇 (16/17)。
[0069] 化合物結(jié)構(gòu)如下： r00701
[00711
[
[
[0074] 實(shí)施例5單體化合物對化化T增殖的影響
[0075] CCK-8法檢測分離得到的單體化合物對角質(zhì)形成細(xì)胞化化T增殖的影響，比較各化 合物的IC50值，W維A酸作為陽性對照藥。結(jié)果顯示，除化合物2，3，6，10，15，16，17外，其余 化合都對化化T細(xì)胞有一定的增殖抑制的能力(表3)。其中化合物4,9,11的抑制作用接近 陽性藥維A酸(52.67皿〇1/1)。
[0076] 表3部分單體化合物對化化T細(xì)胞的抑制效應(yīng)的IC5〇( J劫，n = 3)
[0077]
[007引實(shí)施例6化合物對TNF-a刺激的化化T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響
[0079] 對分離得到的單體化合物進(jìn)行抗炎活性篩選，采用Elisa法測定TNF-a刺激的 化化T細(xì)胞上清中化-巧日比-6的含量，W化合物4搬皮素作為陽性對照藥。結(jié)果顯示，化合物 對TNF-a刺激的化化T細(xì)胞IL-I分泌量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但能在一定程度上減少IL-6的分 泌(表4)。
[0080] 表4單體化合物對TNF-a刺激的化化T細(xì)胞生成化-巧日化-6生成的抑制作用（;as，n =3)
[0081]
[0082] 注:與模型組相比*P<0.05
[0083] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)研究表明：中藥澤漆50%-95%醇提取物，及其石油酸部位(Fra)氯仿 部位(Frb)能較好的抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖，同時該部位分離所得的單體化合 物在抑制角質(zhì)形成細(xì)胞及降低炎癥因子(比-6)方面都有良好效果。
[0084] 本發(fā)明澤漆醇提取物的原藥資源豐富，具有良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。
[0085] 本發(fā)明為將澤漆進(jìn)一步開發(fā)成新藥提供了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種澤漆提取物，采用50 %以上濃度的乙醇提取澤漆得到。2. 權(quán)利要求1所述的澤漆提取物，采用70-95%濃度的乙醇提取澤漆，得到的提取物繼 續(xù)采用石油醚萃取得到。3. 權(quán)利要求1所述的澤漆提取物，采用70-95%濃度的乙醇提取，石油醚萃取后，水層繼 續(xù)采用氯仿萃取得到。4. 權(quán)利要求2所述的澤漆提取物，其特征在于含有式1化合物，式11化合物，式12化合 物，式13化合物，式14化合物。5. 權(quán)利要求4所述的澤漆提取物，其特征在于含有大于0.8467 %重量比例的式1化合 物，大于0.0367%重量比例的式11化合物，含有大于0.456%重量比例的式12化合物，含有 大于0.0227 %重量比例的式13化合物，含有大于0.03 %重量比例的式14化合物。6. 權(quán)利要求2所述的澤漆提取物，是式1或式11-14的化合物。7. 權(quán)利要求3所述的澤漆提取物，其特征在于含有式4化合物，式5化合物，式7化合物， 式8化合物，式9化合物。8. 權(quán)利要求7所述的澤漆提取物，其特征在于含有大于0.0148 %重量比例的式4化合 物，大于ο. 0071 %重量比例的式5化合物，含有大于0.0071 %重量比例的式7化合物，含有大 于0.0048 %重量比例的式8化合物，含有大于0.038 %重量比例的式9化合物。9. 權(quán)利要求3所述的澤漆提取物，是式4、式5或式7-9的化合物。10. 權(quán)利要求1所述澤漆提取物的制備方法，采用澤漆重量3~5倍量的90 %~95 %乙醇 回流提取2~4次，合并提取液，過濾，減壓蒸干即得。11. 權(quán)利要求5所述澤漆提取物的制備方法，采用澤漆重量3~5倍量的90 %~95 %乙醇 回流提取2~4次得到的提取物繼續(xù)加水混懸后，用等體積石油醚反復(fù)萃取2~4次，合并萃 取液，蒸干溶劑即得。12. 權(quán)利要求6所述澤漆提取物的制備方法，采用澤漆重量3~5倍量的90 %~95 %乙醇 回流提取2~4次得到的提取物繼續(xù)加水混懸后，用等體積石油醚反復(fù)萃取2~4次，合并萃 取液，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜以及重結(jié)晶的方法進(jìn)一步分離和純化即得。13. 權(quán)利要求8所述澤漆提取物的制備方法，采用澤漆重量3~5倍量的90 %~95 %乙醇 回流提取2~4次得到的提取物繼續(xù)加水混懸后，用等體積石油醚反復(fù)萃取2~4次，水層用 等體積氯仿反復(fù)萃取2~4次，合并萃取液，蒸干溶劑即得。14. 權(quán)利要求9所述澤漆提取物的制備方法，采用澤漆重量3~5倍量的90 %~95 %乙醇 回流提取2~4次得到的提取物繼續(xù)加水混懸后，用等體積石油醚反復(fù)萃取2~4次，水層用 等體積氯仿反復(fù)萃取2~4次，合并萃取液，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜以及重結(jié)晶的方法進(jìn)一步分 離和純化即得。15. 權(quán)利要求1~9任一項(xiàng)所述澤漆提取物在制備治療銀肩病的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了澤漆提取物，采用50%以上濃度的乙醇提取澤漆得到。還可以繼續(xù)采用石油醚或氯仿提取，甚至分離得到單體化合物。澤漆提取物可用于制備治療銀屑病的藥物。
【IPC分類】C07D493/04, A61P17/06, C07C67/48, C07D311/64, C07C69/78, C07D311/60, C07C29/74, C07C45/90, C07D311/62, C07C49/727, C07C31/02
【公開號】CN105669378
【申請?zhí)枴緾N201610016841
【發(fā)明人】吳繁榮, 陳飛虎, 趙杰
【申請人】安徽醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年1月6日