2%、10%、50%人參總基因組（總濃度均為2以 8/^)的 三七基因組進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，DNA實(shí)時熒光定量PCR的條件相同，均是按照實(shí)施例1中 的步驟(2)操作;最后，分別測試所得擴(kuò)增結(jié)果的高分辨熔融曲線，測試條件為95°C變性，40 。(:復(fù)性30s，65 °C保持1 s，從65 °C以4.4°C/s的速度緩慢升溫95 °C至DNA雙鏈完全打開，升溫 過程中采集熒光，每個樣品測試兩次，所得結(jié)果如圖6A、圖6B所示，其中，圖6A為三七總DNA 及三七基因組摻入不同比例人參基因組的歸一化和變換熔解曲線，圖6B為三七總DNA及三 七基因組摻入不同比例人參基因組的歸一化和熔解度差異曲線，從圖6A及圖6B中可以看出 2 %的人參基因摻偽就可以有效地被檢出。
[0109] 實(shí)施例4關(guān)于熒光PCR定量檢測
[0110] 本實(shí)施例分別稱取相同的三七對照藥材30mg(l號）、20mg(2號）、10mg(3號）按實(shí)施 例1中的步驟⑴在相同的條件下提取總DNA;對所得的總DNA，以SEQ ID NO: 1及2，按實(shí)施例 1中的步驟(2)，在相同的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光定量擴(kuò)增，其中，每個樣品測試兩次，所得結(jié) 果如圖7所示，從圖7中可以看出不同濃度的PCR產(chǎn)物的出峰時間(Ct值)相差約為0.5個循環(huán) 左右，與所稱質(zhì)量相符。
[0111] 另外，將1號樣品基因組進(jìn)行稀釋，以得到1倍，1/10倍，1/100倍，1/1000倍濃度的 三七基因組，在上述相同的條件下進(jìn)行熒光PCR檢測，所得結(jié)果如圖8所示，從圖8中可以看 出，不同濃度的PCR產(chǎn)物的出峰時間(Ct值)相差約為3個循環(huán)左右，與所稱質(zhì)量相符。
[0112]實(shí)施例5PCR擴(kuò)增體系lightcycler 480 HRM master mix(2倍濃度），MgCl2(25mM) 試劑用量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0113] 以實(shí)施例1中提取的三七的總DNA為模板，采用羅氏LightCycler? 480II實(shí)時熒光定 量PCR系統(tǒng)對其進(jìn)行擴(kuò)增，其中，改變MgCl2(25mM)試劑的用量，分別在25yL的PCR反應(yīng)體系 中加入2.0、2.5、3.0、3.5、4. OyL的MgCl2試劑進(jìn)行檢測，該P(yáng)CR反應(yīng)體系中其他試劑及其用 量均同實(shí)施例1，按實(shí)施例1中的步驟(2)分別擴(kuò)增，所得結(jié)果如圖9所示，從圖9中可以看出 MgCl2試劑濃度在3. OyL時PCR擴(kuò)增效率更高。
[0114] 以實(shí)施例1中提取的三七的總DNA為模板，采用羅氏LighiCyc丨crS480II實(shí)時熒光定 量PCR系統(tǒng)對其進(jìn)行擴(kuò)增，其中，改變lightcycler 480 HRM master mix(2倍濃度）的用量， 設(shè)定按25yL加入12.5yL為1倍體積量，在梯度實(shí)驗(yàn)中選擇1.2、1、0.8倍體積量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該 PCR反應(yīng)體系中其他試劑及其用量均同實(shí)施例1，按實(shí)施例1中的步驟(2)分別擴(kuò)增，所得結(jié) 果如圖10所示，從圖10中可以看出在lightcycler 480 HRM master mix(2倍濃度)為1倍體 積時PCR擴(kuò)增效果最佳。
[0115] 最后說明的是：以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的實(shí)施過程和特點(diǎn)，而非限制本發(fā) 明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解:依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何 修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測樣品中是否存在五加科植物成分的方法，該方法包括： 從待檢樣品中提取總DNA; 以所提取的總DNA為模板，利用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物對包括SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2； SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG； SEQ IDN0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG； 對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析判斷以鑒別所述檢測樣品中是否存在五加科植物成分； 優(yōu)選地，所述對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析判斷包括用凝膠電泳顯示所述擴(kuò)增產(chǎn)物，并 包括對照從相應(yīng)的五加科植物對照品中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果； 優(yōu)選地，所述五加科植物選自三七、人參和/或西洋參。2. -種鑒定待檢三七樣品中是否摻偽的方法，所述方法包括如下步驟： 從待檢三七樣品中提取總DNA; 以所提取的總DNA為模板，利用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物對包括SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2； SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG； SEQ IDN0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG； 測試上述擴(kuò)增結(jié)果的高分辨熔解曲線并進(jìn)行分析判斷待檢三七樣品是否摻偽； 優(yōu)選地，用于摻偽的偽品為人參和/或西洋參，更優(yōu)選地，所述偽品為人參。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述測試上述擴(kuò)增結(jié)果的高分辨熔解曲線包括從 40°C以上，以2~4.5°C/s的速度，升溫至95°C，測試所述擴(kuò)增結(jié)果的熔解曲線的過程;優(yōu)選 地，將上述擴(kuò)增結(jié)果95°C變性lmin，40°C復(fù)性30s，65°C保持ls，從65°C以4.4°C/s升溫至95 °C，在升溫過程中采集信號。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述從待檢三七樣品中提取總DNA的過程包括如 下步驟： 在待檢三七樣品中加入液氮進(jìn)行研磨； 加入用于提取植物DNA的含離子型表面活性劑的緩沖液，在60°C~70°C消化5min~4小 時； 用氯仿法或酚仿法抽提； 加入醇溶劑沉淀富集DNA; 利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，得到所提取的總DNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增為熒光定量PCR擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，擴(kuò)增30個 循環(huán)以上。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述待檢三七樣品為中藥細(xì)粉、中藥最細(xì)粉或中 藥極細(xì)粉； 所述中藥細(xì)粉指能全部通過五號篩，并含能通過六號篩不少于95 %的粉末； 所述中藥最細(xì)粉指能全部通過六號篩，并含能通過七號篩不少于95 %的粉末； 所述中藥極細(xì)粉指能全部通過八號篩，并含能通過九號篩不少于95%的粉末。7. 根據(jù)權(quán)利要求2~6中任一項(xiàng)所述的方法，該方法還包括： 將待檢三七樣品的高分辨熔解曲線與從三七對照品中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測試得 到的高分辨熔解曲線對照，分析判斷待檢三七樣品是否摻偽； 當(dāng)待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線與三七對照藥材PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲 線具有基本相同的熔解特征時，表明待檢三七樣品未摻偽； 當(dāng)待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線與三七對照藥材PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲 線具有不同的熔解特征時，表明待檢三七樣品摻偽，當(dāng)待檢三七樣品沒有PCR產(chǎn)物檢出時， 表明樣品中不含有三七藥材。8. 用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述檢測樣品中是否存在五加科植物成分的方法的引物對，或 權(quán)利要求2~7中任一項(xiàng)所述鑒定待檢三七樣品中是否摻偽的方法的引物對，所述引物對包 括SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2; SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG； SEQ ID N0:2:CGCACGACATGAGAAGAGG。9. 權(quán)利要求8所述的引物對在檢測樣品中是否存在五加科植物成分或鑒定待檢三七樣 品是否摻偽中的應(yīng)用。10. -種鑒定待檢三七樣品是否摻偽的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求8所述的引物 對;優(yōu)選地，該試劑盒還包括熒光染料和Mg2+試劑;更優(yōu)選該試劑盒還包括dNTPs、DNA聚合酶 和PCR緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明提供檢測樣品中是否存在五加科植物成分及是否摻偽的方法，檢測樣品中是否存在五加科植物成分的方法包括：從待檢樣品中提取總DNA；以所提取的總DNA為模板，利用引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物對包括SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2；對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析判斷以鑒別所述檢測樣品中是否存在五加科植物成分。本發(fā)明SEQ？ID？NO:1和2為根據(jù)真核生物r？DNA上的ITS2順反子序列設(shè)計，相較于ITS2的通用序列，其能特異性地使五加科植物的ITS？2片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，而不能擴(kuò)增其它科屬的植物藥材，可以檢測樣品中是否存在五加科植物成分，尤其是人參、三七和/或西洋參成分。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105624291
【申請?zhí)枴緾N201610034379
【發(fā)明人】王菲菲, 張聿梅, 戴忠, 馬雙成
【申請人】中國食品藥品檢定研究院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年1月19日