39] 所述中藥細(xì)粉指能全部通過五號篩，并含能通過六號篩不少于95%的粉末；
[0040] 所述中藥最細(xì)粉指能全部通過六號篩，并含能通過七號篩不少于95%的粉末；
[0041] 所述中藥極細(xì)粉指能全部通過八號篩，并含能通過九號篩不少于95%的粉末。 [0042]本發(fā)明所述中藥細(xì)粉、中藥最細(xì)粉或中藥極細(xì)粉的定義與《中國藥典》2015版中的 定義相同。如上所述，對于粉末狀的待檢三七樣品，現(xiàn)有技術(shù)難以提供鑒定其是否摻假的有 效方法，尤其是摻入人參、西洋參等同屬粉末的方法，本發(fā)明采用SEQ ID NO: 1和2引物對對 所提取到的總DNA中的ITS 2序列進(jìn)行擴(kuò)增，再利用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)可有效解決 該技術(shù)問題。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明所述鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法 中，所述測試上述擴(kuò)增結(jié)果的高分辨熔解曲線包括從40°C以上，以2~4.5°C/s的速度，升溫 至95°C，測試所述擴(kuò)增結(jié)果的熔解曲線的過程。優(yōu)選地，將上述擴(kuò)增結(jié)果95°C變性lmin，40 。(:復(fù)性30s，65 °C保持1 s，從65 °C以4.4°C /s升溫至95 °C，在升溫過程中采集信號。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明所述鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法 中，所述從待檢三七樣品中提取總DNA的過程包括如下步驟：
[0045] 在待檢三七樣品中加入液氮進(jìn)行研磨；
[0046] 加入用于提取植物DNA的含離子型表面活性劑的緩沖液，在60 °C~70°C消化5min ~4小時；
[0047]用氯仿法或酚仿法抽提；
[0048]加入醇類溶劑沉淀富集DNA;
[0049] 利用PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，得到所提取的總DNA。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明所述鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法 中，所述PCR擴(kuò)增為熒光定量PCR擴(kuò)增；
[0051 ] PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min;95°C變性3〇8,56°(：退火3〇8,72°(：延伸458，擴(kuò)增 進(jìn)行30個循環(huán)以上。
[0052]本發(fā)明PCR擴(kuò)增體系可選用反應(yīng)體系為25μ1，其中上下游引物SEQ ID N0:1及2(濃 度2μΜ)各lyL，提取得到的總DNA(濃度0 · O1μg/μL以上）lyL，lightcycler480HRM master mix(2倍濃度）12.5以1^，]\%(：12(25_〇1^)3.(^1^其余用(1(1!1 20補(bǔ)至總反應(yīng)體系254匕
[0053] 本發(fā)明所述lightcycler 480HRM master mix可商夠獲得。
[0054] 熒光定量PCR擴(kuò)增通過對目的基因熒光強(qiáng)度的實時檢測，可以快速、準(zhǔn)確、實時地 對反應(yīng)樣品PCR擴(kuò)增的狀況，與普通PCR反應(yīng)相比，它特異性更高，反應(yīng)不需電泳驗證，實現(xiàn) 了真正的閉管操作等優(yōu)點，在臨床疾病診斷和物種資源鑒定中發(fā)揮了重要作用。此外，通過 熒光定量PCR擴(kuò)增還可對樣品中的三七基因?qū)崿F(xiàn)定量分析。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，在本發(fā)明所述鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法 中，該方法還包括：
[0056]將待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線與從三七對照品中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增后測試得到的高分辨熔解曲線對照，分析判斷待檢三七樣品是否摻偽；
[0057]當(dāng)待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線與三七對照藥材PCR產(chǎn)物的高分辨熔 解曲線具有基本相同的熔解特征時，表明待檢三七樣品未摻偽；
[0058]當(dāng)待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線與三七對照藥材PCR產(chǎn)物的高分辨熔 解曲線具有不同的熔解特征時，表明待檢三七樣品摻偽，當(dāng)待檢三七樣品沒有PCR產(chǎn)物檢出 時，表明樣品中不含三七藥材。
[0059]本發(fā)明所述基本相同的熔解特征通常是指待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲 線與三七對照藥材PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線能夠重合，或在本領(lǐng)域允許的誤差范圍內(nèi)基 本重合。
[0060] 本發(fā)明不同的熔解特征通常是指待檢三七樣品PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線與三七 對照藥材PCR產(chǎn)物的高分辨熔解曲線無法重合，或即使本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮可允許的誤差 的情況下也不能基本重合。本領(lǐng)域允許的誤差為±5%，優(yōu)選±2%。
[0061] 另一方面，本發(fā)明提供用于實現(xiàn)本發(fā)明所述檢測樣品中是否存在五加科植物成分 的方法或鑒定待檢三七樣品中是否摻偽的方法的引物對，所述引物對包括SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2；
[0062] SEQ ID NO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0063] SEQ ID N0:2:CGCACGACATGAGAAGAGG。
[0064] 再一方面，本發(fā)明提供所述的引物對在檢測樣品中是否存在五加科植物成分或在 鑒定待檢三七樣品是否摻偽中的應(yīng)用。
[0065]再一方面，本發(fā)明提供一種鑒定待檢三七樣品是否摻偽的試劑盒，該試劑盒包含 本發(fā)明所述的引物對;優(yōu)選地，該試劑盒還包括熒光染料和Mg2+試劑;更優(yōu)選該試劑盒還包 括dNTPs、DNA聚合酶和PCR緩沖液。
[0066]綜上所述，本發(fā)明主要提供檢測樣品中是否存在五加科植物成分以及鑒定待檢三 七樣品是否摻偽的方法，其中，鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法是在在利用本發(fā)明所述 引物對特異性擴(kuò)增三七、人參、西洋參ITS2序列的基礎(chǔ)上，再利用高分辨率熔解曲線分析技 術(shù)。其可對三七樣品中是否摻入植物源性中藥材/飲片粉末實現(xiàn)快速，準(zhǔn)確性高的檢測，尤 其是針對在三七粉末制劑中摻入同屬粉末的檢測。
【附圖說明】
[0067] 圖1為實施例1中SEQ ID N0:1和2對三七、人參、西洋參的總DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖； [0068]圖2A為實施例2中采用ITS 2通用引物擴(kuò)增的PCR結(jié)果圖；
[0069]圖2B為實施例2中采用SEQ ID N0:1及2擴(kuò)增的PCR結(jié)果圖；
[0070]圖3A為實施例2中ITS 2通用引物對三七、人參的總DNA的擴(kuò)增曲線；
[0071] 圖3B為實施例2中SEQ ID NO: 1和2引物對三七、人參的總DNA的擴(kuò)增曲線；
[0072]圖4A為實施例2中ITS 2通用引物的三七、人參高分辨熔解曲線圖；
[0073]圖4B為實施例2中SEQ ID NO: 1和2引物的三七、人參高分辨熔解曲線圖；
[0074]圖5A為實施例3中三七、人參、西洋參歸一化和變換熔解曲線；
[0075]圖5B為圖5A的歸一化和熔解度差異曲線；
[0076]圖6A為實施例3中三七總DNA及三七基因組摻入不同比例人參基因組的歸一化和 變換熔解曲線；
[0077]圖6B為實施例3中三七總DNA及三七基因組摻入不同比例人參基因組的歸一化和 熔解度差異曲線；
[0078] 圖7為實施例4中三七藥材30mg、20mg和10mg的熒光PCR擴(kuò)增曲線；
[0079] 圖8為實施例4中三七基因組1倍、1/10倍、1/100倍和1/1000稀釋的熒光PCR擴(kuò)增曲 線；
[0080] 圖9為實施例5中不同濃度MgCl2試劑的PCR擴(kuò)增曲線；
[0081 ] 圖10為實施例5中不同濃度lightcycler 480 HRM master mix(2X)的PCR擴(kuò)增曲 線。
【具體實施方式】
[0082] 為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實施 例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說明，應(yīng)理解這些實例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實驗 方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照儀器制造商所建議的條件。
[0083] 實施例1SEQ ID N0:1和2對三七、人參、西洋參的PCR擴(kuò)增
[0084] (1)分別取三七、人參、西洋粉末各30mg，采用植物基因組DNA提取試劑盒(Plant Genomic DNA Kit，離心柱型，目錄編號：DP305，TIANGEN BI0TECH(BEIJING)C0.，LTD)分別 提取三七、人參、西洋參的總DNA，具體而言：
[0085] (a)加入液氮充分研磨；
[0086] (b)將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700yL 65°C預(yù)熱緩沖液GP1的離心管中 (實驗前在預(yù)熱的GP1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1 % )，迅速顛倒混勻后，將離心管放 在65°C水浴20