檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分及是否摻偽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分及是否摻偽的方法，尤其涉及檢 測(cè)待檢三七樣品中是否摻偽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 五加科植物為雙子葉植物，可供藥用的五加科植物包括人參、三七、西洋參等，目 前對(duì)于五加科植物的鑒別主要采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，依賴鑒別人員經(jīng)驗(yàn)，主觀性高，因此需 要一種能夠準(zhǔn)確、有效的鑒別方法。
[0003] 在含五加科植物成分的混合物例如藥材、或者以五加科植物入藥的中藥制劑等的 生產(chǎn)加工過(guò)程中，部分DNA通常能夠保留于其中，因此，混合物中的五加科植物成分可以從 其攜帶的DNA檢測(cè)中獲得鑒定。
[0004] 然而，在混合物特別是藥材、中藥制劑中五加科植物成分鑒定的研究技術(shù)上，由于 混合物中五加科植物DNA含量很低，并且含有多種抑制PCR反應(yīng)的成分，此外，含五加科植物 的混合物特別是中藥制劑中通常還具有較多的其它動(dòng)植物物種，因此，如何設(shè)計(jì)五加科植 物特異性引物也成為鑒定技術(shù)的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分的方法，所 述方法具有特異性強(qiáng)、速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法，該方法具有 特異性強(qiáng)、速度快、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于提供實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成 分的方法或鑒定待檢三七樣品中是否摻偽的方法的引物對(duì)。
[0008] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述引物對(duì)的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供包含所述引物對(duì)的試劑盒。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分的方法， 該方法包括：
[0011]從待檢樣品中提取總DNA;
[0012] 以所提取的總DNA為模板，利用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;所述引物對(duì)包括SEQ ID NO: 1 和SEQ ID N0:2;
[0013] SEQ ID N0：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0014] SEQ ID N0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；
[0015] 對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析判斷以鑒別所述檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成 分。
[0016] 優(yōu)選地，在本發(fā)明檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分的方法中，所述對(duì)上述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析判斷包括用凝膠電泳顯示所述擴(kuò)增產(chǎn)物，并包括對(duì)照與從相應(yīng)的五加科 植物對(duì)照品中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
[0017] 本發(fā)明所述"相應(yīng)的五加科植物對(duì)照品"取決于待檢五加科植物的種類，例如當(dāng)本 發(fā)明用于檢測(cè)樣品中是否存在三七成分時(shí)，"相應(yīng)的五加科植物對(duì)照品"即為三七對(duì)照品。 優(yōu)選地，在本發(fā)明檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分的方法中，所述五加科植物選自三 七、人參和/或西洋參。
[0018] 本發(fā)明SEQ ID N0:1和2為根據(jù)真核生物r DNA上的ITS2順反子序列設(shè)計(jì)，相較于 ITS 2的通用序列，其能特異性地使五加科植物的ITS 2片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，尤其是特異性 地使人參、三七、西洋參的ITS2片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，而不能擴(kuò)增其它科屬的植物藥材，因此， 可以檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分，尤其是人參、三七和/或西洋參成分。
[0019] 三七屬于五加科植物，其具有止血、活血化瘀、消腫定痛、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗疲勞、耐缺 氧、抗衰老、降血脂、降血糖、提高機(jī)體免疫功能等作用，近來(lái)受到追捧，尤其是三七細(xì)粉、三 七最細(xì)粉或三七極細(xì)粉，價(jià)格居高不下，不法商販為謀求利益通常會(huì)在三七細(xì)粉中摻入植 物源性中藥材/飲片粉末，例如五加科植物的粉末，以減低成本，按現(xiàn)有的鑒別方法，摻入植 物源性中藥材/飲片粉末的三七細(xì)粉很難被鑒別出來(lái)，一方面主要是因?yàn)樗幉姆勰┍黄扑?成最細(xì)粉或極細(xì)粉后就沒有了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，檢測(cè)人員很難通過(guò)亞細(xì)胞結(jié)果的觀察來(lái)辨別中藥 材的來(lái)源和種屬。另一方面，在化學(xué)成分檢測(cè)中，《中國(guó)藥典》的要求是主要成分人參皂苷 Rbi、人參皂苷Re、人參皂苷Rgl以及三七皂苷Ri檢出（定性，薄層色譜)或規(guī)定人參皂苷Rgl、 人參皂苷Rbi以及三七皂苷辦的總量不得少于5.0% (定量，高效液相色譜），但是對(duì)于和三七 藥材同屬的非藥用植物或價(jià)格較低廉的同屬藥材，也可能含有較高量的待測(cè)化學(xué)成分，但 并無(wú)三七藥材所具有的藥用功效，或者不法分子可以人為摻入一些規(guī)定的檢定成分，類似 于牛奶中摻入三聚氰胺的原理，以干擾檢驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果，從而達(dá)到降低成本的目的。例如，較 人參等五加科植物，三七的檢測(cè)僅多了一項(xiàng)三七特有的三七皂苷Ri的檢測(cè)，但不同大小和 生長(zhǎng)年份的三七，其三七皂苷心含量相差較明顯，因此，即使摻入人參后，通過(guò)化學(xué)成分檢 測(cè)也很難發(fā)現(xiàn)。
[0020] 盡管可將待測(cè)三七制劑的PCR擴(kuò)增結(jié)果與從三七中提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn) 行對(duì)照，以確定待檢三七制劑是否摻偽，但應(yīng)用PCR擴(kuò)增方法具有如下缺陷：
[0021] ①所用時(shí)間較長(zhǎng)，一般的藥材基因組提取到PCR完成大概學(xué)要1天的時(shí)間，再送去 測(cè)序一般需要48小時(shí)，再進(jìn)行分析，一個(gè)檢測(cè)過(guò)程大概需要3~4天；
[0022] ②用于藥材粉末很多情況下是真品和偽品的混合物，若采用通用引物進(jìn)行檢測(cè)， 所得的PCR產(chǎn)物也是兩種或多種植物的混合DNA產(chǎn)物，測(cè)序時(shí)會(huì)出現(xiàn)大量雜峰堆積在一起無(wú) 法分析的現(xiàn)象。
[0023]本發(fā)明在利用所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增三七、人參、西洋參ITS2序列的基礎(chǔ)上，還可 開發(fā)出一種鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法，具體而言，本發(fā)明還可提供一種鑒定待檢 三七樣品是否摻偽的方法，所述方法包括如下步驟：
[0024] 從待檢三七樣品中提取總DNA;
[0025]以所提取的總DNA為模板，利用引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;所述引物對(duì)包括SEQ ID NO: 1 和SEQ ID NO:2;
[0026] SEQ ID NO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0027] SEQ IDN0：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；
[0028]測(cè)試上述擴(kuò)增結(jié)果的高分辨熔解曲線(HRM)并進(jìn)行分析判斷待檢三七樣品是否摻 偽。
[0029] 如上所述，本發(fā)明SEQ ID N0:1和2為根據(jù)真核生物r DNA上的ITS2順反子序列設(shè) 計(jì)，相較于ITS 2的通用序列，其能特異性地使五加科植物的ITS 2片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，尤其 是特異性地使人參、三七、西洋參的ITS2片段序列進(jìn)行擴(kuò)增，而不能擴(kuò)增其它科屬的植物藥 材，因此，可以檢測(cè)樣品中是否存在五加科植物成分，尤其是人參、三七和/或西洋參成分。 但如果僅僅利用PCR結(jié)果的凝膠電泳難以快速將人參、三七和西洋參區(qū)分開來(lái)的，這主要是 因?yàn)槿藚?、三七和西洋參均屬于五加科植物，采用SEQ ID NO: 1和2對(duì)三種藥材進(jìn)行PCR反 應(yīng)，所得PCR產(chǎn)物片斷大小相同，僅僅有個(gè)別堿基存在差異，人參、三七、西洋參PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 分別如下所示：
[0030]人參（Panax ginseng)
[0031]
[0036]因此，僅僅利用PCR結(jié)果的凝膠電泳對(duì)SEQ ID NO: 1和2擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析 是難以快速將人參、三七或西洋參鑒別出來(lái)。如果樣品是粉末，現(xiàn)有技術(shù)手段更是無(wú)能為 力，這主要是因?yàn)楝F(xiàn)有的粉末一般無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無(wú)法采用顯微技術(shù);而對(duì)于化學(xué)成分檢測(cè)， 由于三七的檢測(cè)較人參、西洋參僅多了一項(xiàng)三七特有的三七皂苷Ri的檢測(cè)，但不同大小和 生長(zhǎng)年份的三七，其三七皂苷辦含量相差較明顯，因此，即使摻入人參、西洋參后，通過(guò)化學(xué) 成分檢測(cè)也很難發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)高分辨率熔融曲線(HRM)可以有效區(qū)分如上所述的僅有 個(gè)別堿基差異的三七、人參、西洋參的PCR產(chǎn)物，從而能有效鑒定待檢三七樣品是否摻偽。 [0037]優(yōu)選地，在本發(fā)明所述鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法中，用于摻偽的偽品為 人參和/或西洋參，更優(yōu)選地，所述偽品為人參。人參、西洋參與三七為同屬植物，本發(fā)明采 用SEQ ID NO: 1和2引物對(duì)所提取到的總DNA中的ITS 2序列進(jìn)行擴(kuò)增，再利用高分辨率熔解 曲線分析技術(shù)，可對(duì)三七樣品中是否摻入人參、西洋參實(shí)現(xiàn)快速，準(zhǔn)確性高的檢測(cè)。本發(fā)明 僅僅需要約5~7個(gè)小時(shí)就可以完成從基因組DNA提取到樣品分析的全過(guò)程。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，在本發(fā)明所述鑒定待檢三七樣品是否摻偽的方法 中，所述待檢三七樣品為中藥細(xì)粉、中藥最細(xì)粉或中藥極細(xì)粉；
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