min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；
[0087] (c)加入700yL酸/氯仿（v/v 1:1)，充分混勾，12000rpm(~13400Xg)離心5min;
[0088] (d)小心的將上一步所得水層上相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700yL緩沖液GP2， 充分混勻；
[0089] (e)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rpm(~13,400Xg)離心30s，棄掉廢液 (吸附柱容積為700yL左右，可分次加入離心）；
[0090] (f)向吸附柱CB3中加入500yL緩沖液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm(~13400 X g)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0091] (g)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm(~13，400 X g)離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0092] (h)重復(fù)操作步驟（g)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(~13400Xg)離心 2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液； 該步目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng) (酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)；
[0093] (i)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50yL pH為7.0~8.5的洗脫緩沖液TE，室溫放置2~5min，12000rpm(~13，400 X g)離心2min，將提 取的總DNA溶液收集到離心管中；且DNA產(chǎn)物保存在-20 °C，以防DNA降解，采用Th ermo Fi sher DNA測定儀測得三七、人參、西洋參的總DNA的濃度分別為23yg/yL、30yg/yL、29yg/y L〇
[0094] (2)采用羅氏LighlCycler?480II實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)對步驟（1)提取得到的三 七、人參、西洋參的總DNA分別進(jìn)行實(shí)時熒光定量擴(kuò)增，其中，熒光PCR體系為25yL，其包括上 下游引物SEQ ID N0:1 及2(濃度2μΜ)各lyL，每種樣品的總DNA lyL，lightcycler 480HRM master mix(2倍濃度）12 · 5yL，MgCl2(25mmoL)3 · OyL，其余用ddH20補(bǔ)至總反應(yīng)體系25yL; SEQ ID NO:1及2的序列如下所示：
[0095] SEQ ID NO：1：CGGAGGGGCGGATAATGG；
[0096] SEQ ID NO：2：CGCACGACATGAGAAGAGG；
[0097] SEQ ID NO: 1及2的序列定制合成于上海捷瑞生物工程有限公司。
[0098] PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min;95°C變性3〇8,56°(：退火3〇8,72°(：延伸458，擴(kuò)增 40個循環(huán);每個樣品測試兩次;擴(kuò)增時，采集465~510nm的熒光信號，所得結(jié)果如圖1所示， 從圖1中可以看出本發(fā)明SEQ ID NO: 1及2能夠有效的對三七、人參或西洋參的DNA進(jìn)行擴(kuò) 增，可有效的應(yīng)用于檢測樣品中是否存在五加科植物成分。
[0099] 實(shí)施例2SEQ ID NO: 1和2和ITS 2通用引物的比較
[0100] 以跌打活血散中的多味植物源性藥材為例，對比SEQ ID NO: 1和2與ITS 2通用引 物的PCR擴(kuò)增結(jié)果。跌打活血散中的植物藥材包括紅花、當(dāng)歸、骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、大黃和三七藥 材等，分別稱取30mg各藥材粉末，及人參粉末，按實(shí)施例1中的步驟（1)在相同的條件下，提 取各藥材的總DNA;對每種藥材的總DNA，分別以ITS 2通用引物及SEQ ID NO: 1及2,按實(shí)施 例1中的步驟(2)，在相同的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，其中，每個樣品測試兩次，ITS 2 通用引物的序列為：
[0101] ITS2-3R：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；
[0102] ITS2-2F：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；
[0103] 采用ITS 2通用引物擴(kuò)增的PCR結(jié)果如圖2A所示，采用SEQ ID N0:1及2擴(kuò)增的PCR 結(jié)果如圖2B所示，從圖2A中可以看出采用ITS 2通用引物可以將跌打活血散中的多味植物 源性藥材以及人參藥材擴(kuò)增出，缺乏特異性，因此，采用高分辨熔融曲線(HRM)難以實(shí)現(xiàn)對 跌打活血散制劑中是否含有三七成分的快速鑒別，因?yàn)槠鋸?fù)方成分較多，采用ITS 2通用引 物無特異性擴(kuò)增后，HRM曲線會受非三七成分的干擾，無特異性；從圖2B中可以看出，采用 SEQ ID NO: 1和2引物對可特異性的對三七成分進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，因此，采用HRM可特異性 地快速鑒別跌打活血散中是否含有三七藥材。
[0104]分別稱取30mg三七、人參粉末，按實(shí)施例1中的步驟（1 )，在相同的條件下提取三 七、人參的總DNA，分別以所述ITS 2通用引物及SEQ ID NO: 1及2引物，按實(shí)施例1中的步驟 (2)，在相同的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增，采用ITS 2通用引物擴(kuò)增的PCR結(jié)果如圖3A所 示，采用SEQ ID N0:1及2擴(kuò)增的PCR結(jié)果如圖3B所示，對比圖3A及圖3B可以看出，采用SEQ ID NO: 1和2引物的PCR反應(yīng)，熒光PCR產(chǎn)物更快進(jìn)入平臺期，更符合PCR反應(yīng)過程中，DNA片段 指數(shù)化變化的規(guī)則，證明該P(yáng)CR反應(yīng)效果更好。因此，與ITS2引物相比，本實(shí)施例SEQ ID N0: 1和2引物的熒光PCR效果更好。
[0105]分別稱取30mg三七、人參粉末，按實(shí)施例1中的步驟（1)，在相同的條件下分別提取 三七、人參的總DNA;對每種藥材的總DNA分別以上述ITS 2通用引物以SEQ ID NO: 1及2弓| 物，按實(shí)施例1中的步驟(2)，在相同的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光定量擴(kuò)增，并測試所得擴(kuò)增結(jié)果 的高分辨熔融曲線，測試條件為95 °C變性，40 °C復(fù)性30s，65 °C保持1 s，從65 °C以4.4°C/s的 速度緩慢升溫95°C至DNA雙鏈完全打開，在升溫的過程中采集熒光，每個樣品測試多次，所 得結(jié)果如圖4A、圖4B所示，其中，圖4A為ITS 2通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物的三七、人參高分辨熔解曲 線圖，圖4B為SEQ ID NO: 1和2引物擴(kuò)增產(chǎn)物的三七、人參高分辨熔解曲線圖，從圖4A中可以 看出采用ITS2通用引物進(jìn)行擴(kuò)增的三七和人參樣品，其HRM圖有明顯的雙峰存在，證明PCR 產(chǎn)物有兩個熔點(diǎn)，也就是存在非特異擴(kuò)增產(chǎn)物;從圖4B可以看出，采用SEQ ID NO: 1和2引物 進(jìn)行PCR反應(yīng)，處于較低溫度的PCR產(chǎn)物熔解峰消失，結(jié)果專一性更強(qiáng)。
[0106]實(shí)施例3利用SEQ ID NO: 1及2鑒別待檢測三七樣品中是否摻偽 [0107]分別稱取30mg三七、人參、西洋參的極細(xì)粉末，按實(shí)施例1中的步驟（1 )，在相同的 條件下分別提取三七、人參、西洋參的總DNA;對每種藥材的總DNA以SEQ ID NO: 1及2作為引 物，按實(shí)施例1中的步驟(2)，在相同的條件下進(jìn)行實(shí)時熒光定量擴(kuò)增，并測試所得擴(kuò)增結(jié)果 的高分辨熔融曲線，測試條件為95 °C變性，40 °C復(fù)性30s，65 °C保持1 s，從65 °C以4.4°C/s的 速度緩慢升溫95°C至DNA雙鏈完全打開，升溫的過程中采集熒光，每個樣品測試兩次，所得 結(jié)果如圖5A及圖5B所示，其中，圖5A為三七、人參、西洋參歸一化和變換熔解曲線，圖5B為圖 5A的歸一化和熔解度差異曲線，從圖5A及圖5B可以看出，高分辨率熔融曲線可以有效區(qū)分 如上所述的僅有個別堿基差異的三七、人參、西洋參的PCR產(chǎn)物。
[0108] 近年來，由于三七價格遠(yuǎn)高于人參價格，不法分子將人參粉末摻入三七粉末的現(xiàn) 象多見。為驗(yàn)證本實(shí)施例是否能夠鑒別出待檢三七樣品中摻有人參，本實(shí)施例分別稱取 30mg三七、人參的極細(xì)粉末，按實(shí)施例1中的步驟（1 )，在相同的條件下分別提取三七、人參 的總DNA，并將提到到的三七的總DNA (三七基因組)及人參的總DNA (人參基因組)稀釋為相 同濃度，均為約2yg/yL，并在98yL的濃度為2yg/yL的三七基因組中加入2yL的濃度為2yg/yL 的人參基因組，得含2%人參基因組的三七基因組(含98%的三七基因組），按同樣的操作， 分別制得含1 〇 %人參基因組的三七基因組(含90 %的三七基因組)及含50 %人參基因組的 三七基因組(含50%的三七基因組）；然后使用本發(fā)明所述SEQ ID NO: 1和2引物分別對濃度 為2yg/yL的三七總DNA(100%)、摻有