CACCGGACACGTACCGGTGAGTTACGAGGTGCCCCCCGAGTCCCCGCACGGCCCGGAC CCCGCGCACCTGGAGGAGGCGTGGCAGCGGTGCCGCAGCGAGGGCCTCGACGTCGCCTGCATCCTCATCAACCCGCA GCACAACCCGTGGGGCGGCAACTGGACCCCCGAGTTCCTCGCCGCCGTCGCCGCCCTCGCCGAACGTGAGCGAGTGC CCGTCCTGGTGGACAACGCCTTCTACGGGCTGACCGCCGAGGACGTGCGCCCCACCAGCGCGGTCCGGCTCCTCGGC CATCTCGTCGGCCAGGAACTCCTGGTGTCGGTGCGCAGCCTGAGCAAGCAGTTCGCGTGCAGCGGCTGGGCCCTGGG AGCCGTCGCGGGCAGCCCGGGTCTGGTCTCGGCGTACTCCGGCCGCTGGCGCTGTCTGCGGGAGCCGACCGCGGGCT TCCGCGCCCAGGCGGCGATGGCGGCCTGGCTCGGGGGCGCCGAACCCGAGCGCTTCACCCGGCGCCGCCGATCCGAG GCCACCCGGCACGCCAGGCTCCTGCGCACCACACTGCGCGCGGCGGGGCTGCCCGACGACGCCGTCCTGCACCACGG CGGCGCCCCCTTCACCCTGCTGCGGCCCCCGGGCGGCAGCACGGTCGAGGAGGTGCGCGAGCAGACCGTCGTGCGGC ACGGCGTCCTGCTCGGCCTGGAGCGGGACGCGCGCGAACGGCCGTGGTTCAAGGTCTGGCTGGGCCGGGACAGCAGC GTCTTCGAACCCGCGGCGCGGGCCCTCGGCGACGCCGCGGCCGAGTGGCGGTACCGGTGA (SEQ ID NO. :9)
[0123] 藥物組合物和施用方法
[0124] 本發(fā)明化合物具有優(yōu)良的抑菌（抗菌）活性，因此可用作抗菌素（或抗生素），且 其性質(zhì)有助于制成注射劑。
[0125] 本發(fā)明化合物可施用于哺乳動物（如人），可以口服、直腸、腸胃外（靜脈內(nèi)、肌肉 內(nèi)或皮下）、局部等方式給藥。所述化合物可以單獨(dú)給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合 物聯(lián)合給藥。需要指出，本發(fā)明的化合物可以混合給藥。
[0126] 用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑 型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑（或載體）混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或 與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b) 粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；（c)保濕 劑，例如，甘油；（d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅 酸鹽、和碳酸鈉；（e)緩溶劑，例如石蠟；（f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；（g)潤濕劑，例 如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和（i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸 鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也 可包含緩沖劑。
[0127] 固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和 其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的 釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實例是聚合物質(zhì) 和蠟類物質(zhì)。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
[0128] 用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。 除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增 溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰 胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物 等。
[0129] 除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味 劑和香料。
[0130] 除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯 山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。
[0131] 用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、 懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和 非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
[0132] 用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。 活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要 的推進(jìn)劑一起混合。
[0133] 本發(fā)明化合物可以單獨(dú)給藥，或者與其他活性成分（如抗生素）聯(lián)合給藥。
[0134] 使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明化合物適用于需要治療的哺乳動物 (如人），其中施用時劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對于60kg體重的個體而言，日給 藥劑量通常為1~l〇〇〇mg，優(yōu)選20~500mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、個體健康 狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0135] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：
[0136] 1、本發(fā)明提供了一類結(jié)構(gòu)新穎的林可霉素生物合成中間產(chǎn)物（也可稱為"林可霉 素的衍生物"）。
[0137] 2、本發(fā)明提供了通過林可霉素產(chǎn)生菌的遺傳改造，經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化，可高 產(chǎn)地獲得高純度的所述林可霉素生物合成中間產(chǎn)物。
[0138] 3、以本發(fā)明的林可霉素類似物為基礎(chǔ)，不僅有助于制備其他林可酰胺類抗生素結(jié) 構(gòu)類似物，而且還可方便通過簡單的水解即產(chǎn)生多種極其有用的中間體化合物（包括正丙 基脯氨酸、二糖GlcN-Ins、和/麥角硫因）。
[0139] 4、采用本發(fā)明的生物學(xué)方法制備所述中間體化合物，環(huán)境影響小，制備條件溫和， 適合于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
[0140] 5、采用本發(fā)明方法，不僅可方便地制備多種有用的中間體化合物，而且避免了采 用昂貴和步驟復(fù)雜的全化學(xué)合成，因此具有成本低等綜合優(yōu)勢和應(yīng)用前景。
[0141] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細(xì)條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0142] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0143] 實施例1林可霉素同框敲除突變株的構(gòu)建
[0144] 1.構(gòu)建用于同框敲除的重組質(zhì)粒
[0145] 引物設(shè)計：
[0146] PCR克隆ImbE基因左臂DNA片段的引物序列如下：
[0147] 引物 1 :5' -TATGAATTCCACCTTCACCACGCAGCAGTCC-3' (SEQ ID NO. : 10)
[0148] 引物 2 :5' -TATTCTAGACCTTCCCGTACGAGGAGTACAC-3' (SEQ ID NO. :11)
[0149] PCR克隆ImbE基因右臂DNA片段的引物序列如下：
[0150] 引物 3 :5' -TATTCTAGACGAACCGTTCGGGGGTGAAGTC-3' (SEQ ID NO. : 12)
[0151] 引物 4 :5'-TATAAGCTTCCCGTTGCACACGACGTTTCAC-3'（SEQ ID NO. :13)
[0152] PCR克隆lmbE3457基因左臂DNA片段的引物序列如下：
[0153] 引物 5 :5' -TATGAATTCCTGTTCACCTCCTACGGCGAC-3' (SEQ ID NO. : 14)
[0154] 弓丨物 6 :5'-TATTCTAGAATCCGCGACAAGGCCCTGATC-3'（SEQ ID N0. : 15)PCR 克隆 lmbE3457基因右臂DNA片段的引物序列如下：
[0155] 引物 7 :5' -TATTCTAGAGCGGATCTTCTTCACCAGCTC-3' (SEQ ID NO. : 16)
[0156] 引物 8 :5' -TATAAGCTTCGCCACATCGCCGAATGGAAC-3' (SEQ ID N0. : 17) PCR 克隆 ImbV 基因左臂DNA片段的引物序列如下：
[0157] 引物 9 :5' -TATGAATTCGACGACGCTGACGTAGTGCAGG-3' (SEQ ID NO. : 18)
[0158] 引物 10 :5' -TATTCTAGACTGACCCGTGAGCAGTTCGTGG-3' (SEQ ID N0. : 19) PCR 克隆 ImbV基因右臂DNA片段的引物序列如下：
[0159] 引物 11 :5' -TATTCTAGAGATGTCGTCGTGCACGCATGCC-3' (SEQ ID NO. :20)
[0160] 引物 12 :5' -TATAAGCTTGTCACCGCGGTTGAGCTCGATC-3' (SEQ ID N0. : 21) PCR 克隆 mshA基因左臂DNA片段的引物序列如下：
[0161] 引物 13 :5' -TATGAATTCCGGTTCGATCTCCACACCGACCAC-3' (SEQ ID NO. :22)
[0162] 引物 14 :5' -TATTCTAGACTTGGCCATGGTGTGCATGGCGTG-3' (SEQ ID NO. : 23)PCR 克隆 mshA基因右臂DNA片段的引物序列如下：
[0163] 引物 15 :5' -TATTCTAGACAGACCGGTTTCCTCGTACGAGGG-3' (SEQ ID NO. :24)
[0164] 引物 16 :5' -TATAAGCTTCATGGTCACCCGGCAGGAAGTCAC-3' (SEQ ID NO. : 25) PCR 克隆 ImbC基因左臂DNA片段的引物序列如下：
[0165] 引物 Π :5' -TATGAATTCGGATGTACCGTTTCCTGGACC-3' (SEQ ID NO. :26)
[0166] 弓丨物 18 :5'-TATTCTAGAGGAGGTGGAGAACGCTGTACG-3' (SEQ ID NO. :27)PCR 克隆 ImbC基因右臂DNA片段的引物序列如下：
[0167] 引物 19 :5' -TATTCTAGACCGACCATCCACTCCAGGAAG-3' (SEQ ID NO. :28)
[0168] 引物 20 :5' -TATAAGCTTCAGTCACGTGACCCAAGTACCG-3' (SEQ ID NO. : 29) PCR 克隆 ImbD基因左臂DNA片段的引物序列如下：
[0169] 引物 21 :5' -TATGAATTCCCTGATGCTCCTGTACACCAGC-3' (SEQ ID NO. :30)
[0170] 引物 22 :5' -TATTCTAGAGTCCTCCAGGAACAGCAGACTG-3' (SEQ ID N0. : 31) PCR 克隆 ImbD基因右臂DNA片段的引物序列如下：
[0171] 引物 23 :5' -TATTCTAGACGGTATCTGTTCCTGGGCCTGG-3' (SEQ ID NO. :32)
[0172] 引物 24 :5' -TATAAGCTTGAACGGTACGTGCAACTCCTCG-3' (SEQ ID NO. :33)
[0173] PCR 擴(kuò)增
[0174] 以抽提的林可霉素產(chǎn)生菌林可鏈霉菌Streptomycin lincolnensis NRRL ISP-5355的總DNA為模板，分別用上述各基因左臂和右臂DNA片段特異性引物對的ImbE、 lmbE3457、ImbV、mshA、ImbC和ImbD的上下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，左臂和右臂DNA擴(kuò)增片 段。
[0175] 構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒
[0176] 將各個基因的左臂和右臂兩個片段進(jìn)行凝膠電泳分離，切膠回收純化。加入EcoRI 和Xbal消化左臂片段，Xbal和Hindlll消化下游片段，回收片段之后，將其一同連入用限 制性內(nèi)切酶Hindlll和EcoRI處理過的pKC1139質(zhì)粒（一種溫度敏感的大腸桿菌-鏈霉菌 穿梭質(zhì)粒，參考文獻(xiàn)：美國專利申請US5, 955, 319)，形成各個基因的重組質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒。
[0177] 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌E. coli DH5 a，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液（含 有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/ml)中培養(yǎng)過夜，至菌液較濃。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證后， 進(jìn)行商業(yè)測序，結(jié)果證明，重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0178] 2.同框敲除突變株的構(gòu)建和篩選
[0179] 將驗證正確的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入常規(guī)的甲基化修飾缺失