一種萘酰亞胺雙光子熒光染料、其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于精細(xì)化工領(lǐng)域，涉及一種萘酰亞胺雙光子熒光染料，具體為一種具有 雙光子吸收特性、4-位為低分子量PEI取代的萘酰亞胺化合物及其制備方法，以及這類熒光 染料在生物染色、成像方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雙光子熒光顯微成像采用近紅外光激發(fā)，能夠穿透標(biāo)本，實(shí)現(xiàn)組織、動(dòng)物成像;與 單光子成像相比具有可以避免光致毒、熒光漂白，減小對(duì)細(xì)胞的損傷，高橫向分辨率與縱橫 向分辨率，降低生物組織吸收系數(shù)和自發(fā)熒光干擾、改善成像效果等優(yōu)勢(shì)。實(shí)現(xiàn)雙光子顯微 成像需要雙光子熒光染料，因此，雙光子熒光染料越來(lái)越受到生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷等研究領(lǐng) 域的青睞。某些傳統(tǒng)的熒光染料(如香豆素、熒光素)雖然可以用于雙光子顯微成像，但是由 于它們的雙光子吸收能力太小，使用時(shí)必需用高強(qiáng)度激光激發(fā)，結(jié)果導(dǎo)致生物樣品熱損傷。 目前報(bào)道的具有較強(qiáng)雙光子吸收能力的化合物多數(shù)水溶性較差，不適于在生物體系中應(yīng) 用。生物成像領(lǐng)域常見(jiàn)的雙光子發(fā)色團(tuán)，它們中大多數(shù)的雙光子吸收截面積較低，導(dǎo)致雙光 子激發(fā)熒光亮度較弱，不得已采用增大脈沖激光器功率的方法，來(lái)獲得較強(qiáng)的雙光子激發(fā) 熒光，但是這樣會(huì)對(duì)生物組織或細(xì)胞傷害較大，不利于長(zhǎng)時(shí)研究。通過(guò)物理吸附或者自組裝 把雙光子熒光染料包載到納米材料上，或者通過(guò)化學(xué)鍵把染料修飾到納米材料上均可以改 善染料水溶性，但是受進(jìn)入細(xì)胞方式所限往往需要較長(zhǎng)的染色時(shí)間，并且被包載的雙光子 熒光染料容易伴有滲漏的現(xiàn)象，影響成像效果。因此，開(kāi)發(fā)適于染色、成像用雙光子熒光染 料具有重要的意義。
[0003]萘酰亞胺作為一類重要的綠光區(qū)發(fā)色團(tuán)，具有顯著的非線性光學(xué)特性，可以實(shí)現(xiàn) 近紅外波段的雙光子激發(fā)，它的雙光子吸收截面大(200GM)，熒光量子產(chǎn)率高，使其雙光子 活性吸收截面也大。多數(shù)熒光染料在增大密度(濃度)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)熒光淬滅，但萘酰亞胺因其 具有很大的Stokes位移（IOOnm以上），不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象。以萘酰亞胺為熒光團(tuán)的雙光子熒 光探針越來(lái)越引起人們的關(guān)注，不過(guò)多數(shù)萘酰亞胺化合物水溶性較差，仍然需要溶解在水 和有機(jī)溶劑的混合溶劑中使用，并且具有細(xì)胞毒性。因此，開(kāi)發(fā)性能優(yōu)良的萘酰亞胺類雙光 子熒光染料是研發(fā)用于生物學(xué)、診斷醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用的雙光子熒光染料的一個(gè)有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種萘酰亞胺雙光子熒光染 料、其制備方法和應(yīng)用，該萘酰亞胺化合物具有雙光子吸收特性，水溶性好，生物相容性好， 毒性低，染色時(shí)間短，可用于細(xì)胞核、溶酶體成像，且可實(shí)現(xiàn)非固定的活細(xì)胞染色及成像，并 且細(xì)胞內(nèi)成像時(shí)無(wú)滲漏現(xiàn)象。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之一是：
[0006] -種萘酰亞胺化合物，該萘酰亞胺化合物的結(jié)構(gòu)如通式I所示：
[0008] 通式 I
[0009] a)通式I中，PEI是通式Π 所示的支化PEI或通式ΙΠ 所示的線型PEI，分子量不超過(guò) 3000；
[0010] b)通式I中，R1選自以下取代基團(tuán)： 式中:m=l~4，R2和R3分別選自Cl~C6的烷基中一種；
[0015] 一實(shí)施例中：所述PEI分子量為800，1200，2000或2500;PEI分子量過(guò)大會(huì)具有一定 毒性。
[0016 ]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之二是：
[0017] 上述萘酰亞胺化合物的制備方法，包括：
[0018] 1)將4-溴-1，8_萘酐與含有R1基團(tuán)的脂肪胺按照1:1~1.1的摩爾比加入至適量乙 醇中，加熱回流1~4h，得到中間體M;
[0019] 2)取所述PEI與過(guò)量的中間體M反應(yīng):取已預(yù)先除去水分的PEI溶于適量正丁醇;將 過(guò)量的中間體M溶于適量三氯甲烷，再用正丁醇稀釋，得到中間體溶液;將中間體溶液逐滴 滴入至處于加熱回流的上述含有PEI的正丁醇中；滴加完畢后，繼續(xù)加熱回流10~12h;中間 體M過(guò)量是由于PEI與產(chǎn)物不易分離，需要使PEI完全反應(yīng);而將中間體溶液逐滴滴入至含有 PEI的正丁醇中，則可以使得每次都是少量的中間體M和大大過(guò)量的PEI反應(yīng)，從而保證反應(yīng) 順利、充分地進(jìn)行，進(jìn)一步確保PEI能夠被完全反應(yīng)掉；
[0020] 3)將步驟2)得到的的反應(yīng)液濃縮后，加水稀釋，固液分離，棄去固體部分即未反應(yīng) 完全的中間體M;重復(fù)上述濃縮-稀釋-固液分離步驟若干次以完全去除未反應(yīng)的中間體M; 合并濾液，濃縮，干燥，即得產(chǎn)物T，即為所述之萘酰亞胺化合物。
[0021] 合成路線如下式所示：
[0023] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案之三是：
[0024] 上述萘酰亞胺化合物作為熒光染料的應(yīng)用。
[0025] 特別是，上述萘酰亞胺化合物作為雙光子熒光染料的應(yīng)用。
[0026] -實(shí)施例中:所述應(yīng)用為細(xì)胞、組織、器官、動(dòng)物體的染色和/或成像。
[0027] -實(shí)施例中:所述細(xì)胞為非固定的活細(xì)胞。
[0028] -實(shí)施例中:所述雙光子熒光染料在細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞核和/或溶酶體。
[0029] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0030] 1.本發(fā)明提供了一種具有雙光子吸收特性、水溶性好的萘酰亞胺類化合物，可以 作為雙光子熒光染料，并且提供了這類化合物的制備方法，簡(jiǎn)便易行可重復(fù)。
[0031] 2.萘酰亞胺的兩個(gè)羰基具有強(qiáng)吸電子能力，在其4位引入助色團(tuán)后，形成一個(gè)分子 內(nèi)推拉電子共輒體系，能發(fā)出明亮的焚光。聚乙稀亞胺(Polyethy leneimine，PEI)是一種水 溶性高分子聚合物，包括支化(branched PEI，bPEI)和線型（Iinear PEI，IPEI)兩種結(jié)構(gòu)， 相對(duì)分子量從數(shù)百至幾十萬(wàn)不等，無(wú)論哪種結(jié)構(gòu)其基本骨架每三個(gè)原子中就含有一個(gè)氨 基，這使得PEI擁有極強(qiáng)的給電子能力，呈現(xiàn)弱堿性。PEI具有良好的轉(zhuǎn)染效率，作為非病毒 基因載體被廣泛研究，經(jīng)基因載體研究證實(shí)安全、無(wú)毒。本發(fā)明把水溶性的低分子量PEI偶 聯(lián)到萘酰亞胺的4位，作為給電子基團(tuán)、助色團(tuán)，并作為定位基團(tuán)，利用PEI的弱堿性導(dǎo)致的 趨酸性，使其可以定位于溶酶體，使染料可以在細(xì)胞內(nèi)特定部位累積、成像，并改善染料的 水溶性。此外，這種偶聯(lián)方式制得的染料可以避免在細(xì)胞染色、成像時(shí)出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象。
[0032] 3.本發(fā)明的萘酰亞胺化合物可以作為熒光染料，在單光子、雙光子激發(fā)下在非固 定的活細(xì)胞的細(xì)胞核、溶酶體染色成像，也可以在固定細(xì)胞的細(xì)胞核、溶酶體染色成像，且 無(wú)滲漏現(xiàn)象?，F(xiàn)有的多數(shù)熒光染料只能應(yīng)用于固定細(xì)胞樣品染色，無(wú)法在非固定的活細(xì)胞 中成像，而這種固定的方法對(duì)細(xì)胞和組織真實(shí)形態(tài)的觀察往往會(huì)帶來(lái)負(fù)面影響，并且不同 固定細(xì)胞方法會(huì)產(chǎn)生不同的研究結(jié)果;而本發(fā)明的萘酰亞胺化合物在非固定的活細(xì)胞中也 能取得良好的染色、成像效果，因而能夠如實(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，研究細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程 以及分子的細(xì)胞定位等;實(shí)驗(yàn)操作也更方便快捷。
[0033] 4.本發(fā)明的萘酰亞胺化合物容易進(jìn)入細(xì)胞，染色時(shí)間短，與細(xì)胞共孵育5分鐘后即 可染色成像，與細(xì)胞共孵育24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞依然無(wú)毒性，染色、成像效果與染色5分鐘時(shí)相 同，說(shuō)明本發(fā)明的萘酰亞胺化合物毒性較小。
【附圖說(shuō)明】
[0034]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0035]圖1是實(shí)施例1和2中得到的萘酰亞胺化合物T-I、Τ_2在不同激發(fā)波段的雙光子吸 收光譜圖。圖中橫坐標(biāo)(Wavelength/nm)表示測(cè)試時(shí)使用的激發(fā)波長(zhǎng)（單位為nm)，縱坐標(biāo) (δ/GM)表示化合物在對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)下的雙光子吸收截面積(單位GM)。
[0036]圖2是實(shí)施例1中得到的萘酰亞胺化合物T-I在Hela細(xì)胞中用激光掃描共聚焦顯微 鏡成像圖，其中左圖為T(mén)-I成像圖（染色時(shí)間lh，激發(fā)通道488nm)，T-l在細(xì)胞核外呈現(xiàn)點(diǎn)狀 分布(黑白圖片中呈白色亮點(diǎn)的部分），顯示明亮的綠色熒光，推斷可能定位于溶酶體；中圖 為商品化溶酶體染料丨ysoTrackcr? Ited DND-99成像圖（染色時(shí)間5min，激發(fā)通道543nm)，與 T-I有相似的細(xì)胞分布情況（圖2中圖黑白圖片中呈白色亮點(diǎn)的部分），顯示明亮的紅色熒 光;右圖為兩個(gè)圖疊加擬合成像圖，呈現(xiàn)黃色熒光、點(diǎn)狀分布（圖2右圖黑白圖片中呈白色亮 點(diǎn)的部分），表明左圖和中圖兩圖可以很好的疊加，證明T-I能夠?qū)崿F(xiàn)溶酶體成像。
[0037]圖3是實(shí)施例1中得到的萘酰亞胺化合物T-I在Hela細(xì)胞中用雙光子共聚焦顯微鏡 成像圖（染色時(shí)間Ih，激發(fā)通道900nm)，其中左一為T(mén)-I雙光子激發(fā)成像圖，與激光掃描共聚 焦顯微鏡有相似的成像現(xiàn)象，T-I在細(xì)胞核外呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布，顯示明亮的綠色熒光，并且實(shí) 際成像效果明顯好于激光掃描共聚焦成像，表明T-I具有良好的雙光子成像能力。左二為商 品化溶酶體染料lysoT