測 定菌株的生長曲線。
[0043]測定方法:各從斜面挑一環(huán)菌到裝有50mL YPX液體培養(yǎng)基(20g/L木糖，20g/L蛋白 胨，10g/L酵母浸粉）的250mL的搖瓶里，30°C，180rpm條件下培養(yǎng)，定時取樣，適當(dāng)稀釋， 600nm下測定0D值。測定結(jié)果如圖2所示。
[0044]從圖2可以明顯看出，溫度在30°C_41°C之間，雖然隨著溫度的提高，菌株的生長受 到了不同程度的抑制，但仍可明顯看出，U1-58突變株的生長性能與出發(fā)菌株相比均有一定 程度的提高，可見該突變菌株的溫度耐受性優(yōu)于出發(fā)菌株。
[0045] 實施例3:不同溫度下U1-58突變株木糖發(fā)酵性能的測定
[0046] 以U1-58突變株和U1出發(fā)菌株互為對照，在30°(3、33°(3、35°(3、37°(3、39°(3和41°(3測 定菌株的木糖發(fā)酵性能。
[0047] 發(fā)酵條件及發(fā)酵液中代謝物濃度的測定均同實施例1(2)。以發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中殘 余木糖濃度、乙醇濃度以及相應(yīng)糖醇轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)進行分析，發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。
[0048]如圖3所示，在各溫度下U1-58突變株與U1出發(fā)菌株相比，乙醇濃度顯著提高，殘?zhí)?濃度明顯降低，相應(yīng)糖醇轉(zhuǎn)化率也有一定程度的增加。在30°C、33°C、35°C、37°C、39°C、41°C 時，Ul-58突變株乙醇濃度與U1出發(fā)菌株乙醇濃度相比較，分別提高了 13.69%、27.06%、 42.29%、72.05%、89.15%、166.31 %?？梢?，U1-58突變菌株的木糖發(fā)酵能力在各溫度均優(yōu) 于U1出發(fā)菌株，且隨著溫度的升高，U1-58突變株與出發(fā)菌株相比，發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇能力的 差距越來越大，也證實了 U1-58突變株的溫度耐受性優(yōu)于U1出發(fā)菌株。
[0049] 實施例4. U1-58突變株玉米芯酶解液發(fā)酵
[0050]以U1-58突變株和U1出發(fā)菌株互為對照，進行玉米芯酶解液發(fā)酵。發(fā)酵過程中定時 取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中葡萄糖、木糖、甘油、木糖醇和乙醇的濃度。發(fā)酵過程 中各物質(zhì)濃度變化，如圖4所示。
[0051 ] 發(fā)酵過程如下：
[0052]木質(zhì)纖維素酶解液的制備:將玉米芯與檸檬酸緩沖液按固液比1:5投料，纖維素酶 添加量20FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量12000U/g玉米芯，溫度50°C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，酶解 48h，抽濾，除去濾渣，得到酶解液。
[0053]發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:木質(zhì)纖維素酶解液(葡萄糖(73±0.5)g/L，木糖(45±0.5)g/ L)，酵母浸粉22g/L，K2HPO42 · 5g/L，MgS〇4〇 · 1 g/L。115°C下滅菌20min。
[0054] 發(fā)酵條件:裝液量50ml/250ml，初始菌種0D6Q() 5.0，轉(zhuǎn)速120rpm，溫度33°C，初始pH 5.0,發(fā)酵時間為120h。
[0055] 如圖4所示，U1-58突變株在葡萄糖濃度降至50g/L左右開始發(fā)酵木糖，而U1出發(fā)菌 株在葡萄糖濃度降至35g/L左右才開始發(fā)酵木糖，說明在葡萄糖存在的條件下，與U1出發(fā)菌 株相比，U1-58突變株木糖發(fā)酵能力顯著提高。U1-58突變株的葡萄糖消耗在60h基本發(fā)酵完 全，而出發(fā)菌株的葡萄糖消耗持續(xù)至96h，葡萄糖的更快消耗，在一定程度上加快了乙醇的 生成速率。對整個發(fā)酵過程進行數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果分別見表1。
[0056] 表1 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株玉米芯酶解液發(fā)酵結(jié)果
[0058]由表1可知，U1-58突變株酶解液發(fā)酵，乙醇濃度、木糖利用率與U1出發(fā)菌株相比分 別提高38.39%、57.27% ;而木糖醇濃度與殘余木糖濃度分別降低94.22%與92.58%。以上 結(jié)果表明U1-58突變株木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效率較U1出發(fā)菌株。結(jié)合圖4,在發(fā)酵12h至60h之 間，U1-58突變株乙醇生成速率、葡萄糖消耗速率、木糖消耗速率分別達到0.50g/(L · h)、 1.05g/(L · h)、0.41g/(L · h)，分別較U1 出發(fā)菌株提高72.41%、41.89%、156.25%。此結(jié)果 表明，葡萄糖/木糖混糖發(fā)酵條件下，U1-58突變株的木糖利用效率較U1出發(fā)菌株得到了顯 者提尚。
[0059] 實施例5. U1-58突變株玉米芯酶解液發(fā)酵 [0060]以U1-58突變株進行玉米芯酶解液發(fā)酵。
[0061 ] 發(fā)酵過程如下：
[0062]木質(zhì)纖維素酶解液的制備:將玉米芯與ρΗ5.0的檸檬酸緩沖液按固液比1:6投料， 纖維素酶添加量40FPU/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，溫度45°C，搖床轉(zhuǎn)速 180rpm，酶解72h，抽濾，除去濾渣，得到酶解液。
[0063] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:上述酶解液，酵母浸粉26g/L，K2HP〇4 3.5g/L，MgS〇4 0.05g/L。 115°C 下滅菌 20min。
[0064] 發(fā)酵條件:裝液量50ml/250ml，初始菌種0D6Q() 3 · 0，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度30°C，初始pH 5.0，發(fā)酵時間為7211。
[0065] 發(fā)酵結(jié)束后，乙醇濃度達到40.38g/L，殘余木糖濃度0.58g/L，木糖利用率 98.24% .
[0066]實施例6. U1-58突變株進行玉米芯同步糖化共發(fā)酵
[0067] 將原料按一定的固液質(zhì)量比投入反應(yīng)器中，并向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量營養(yǎng)物 質(zhì)、纖維素酶、木聚糖酶、菌種，進行同步糖化共發(fā)酵。以U1-58突變株和U1出發(fā)菌株互為對 照，利用玉米芯進行同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇。發(fā)酵結(jié)束后取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵 液中葡萄糖、木糖和乙醇的濃度，結(jié)果如圖5所示。
[0068] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:將玉米芯與梓檬酸緩沖液按固液比1: 5投料，纖維素酶添加量 20FHJ/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，加入NH4C1 3 · 82g/L，KH2P〇4 3 · Og/L， MgSCU 0.2g/L<3ll5°C下滅菌20min。
[0069] 發(fā)酵條件:裝液量20ml/250ml，菌株初始0D6Q() 5 · 0，轉(zhuǎn)速120rpm，溫度33°C，初始pH 4.9，發(fā)酵時間為9611。
[0070] 如圖5所示，U1-58突變株與出發(fā)菌株相比，乙醇濃度達到49.92g/L，較出發(fā)菌株提 高23.41%;總糖(纖維素+半纖維素)對乙醇的總轉(zhuǎn)化率為0.42,較出發(fā)菌株總轉(zhuǎn)化率提高 22.71% ;纖維素和半纖維素利用率分別達到86.12%、86.86%，較出發(fā)菌株分別高出 4.72%、12.44%。由以上可知，U1-58突變株比U1出發(fā)菌株更適于木質(zhì)纖維素類原料物質(zhì)發(fā) 酵產(chǎn)乙醇。
[0071 ]實施例7. U1-58突變株進行玉米芯同步糖化共發(fā)酵
[0072] 將原料按一定的固液質(zhì)量比投入反應(yīng)器中，并向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量營養(yǎng)物 質(zhì)、纖維素酶、木聚糖酶、菌種，進行同步糖化共發(fā)酵。以U1-58突變株利用玉米芯進行同步 糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇。發(fā)酵結(jié)束后取樣，用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中葡萄糖、木糖和乙醇 的濃度。
[0073] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:將玉米芯與梓檬酸緩沖液按固液比1: 6投料，纖維素酶添加量 20FHJ/g玉米芯，木聚糖酶添加量10000U/g玉米芯，加入NH4C1 2 · 87g/L，KH2P〇4 3 · 5g/L， MgSCU 0.1g/L<3ll5°C下滅菌20min。
[0074] 發(fā)酵條件:裝液量20ml/250ml，菌株初始0D6Q() 8 · 0，轉(zhuǎn)速150rpm，溫度35°C，初始pH 4.9，發(fā)酵時間為7211。
[0075] 發(fā)酵結(jié)束后，乙醇濃度達到38.34g/L，總糖(纖維素+半纖維素)對乙醇的總轉(zhuǎn)化率 為0.39，纖維素和半纖維素利用率分別達到80.65%、82.07%。
【主權(quán)項】
1. 一株高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的突變株，其特征在于，所述菌株具體為為Spathaspora passalidarum U1-58,保藏編號為CGMCC No.11867。2. 利用權(quán)利要求1所述突變株進行高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，具體如下： (1) 按固液質(zhì)量比1:4~1:6將木質(zhì)纖維素原料投入pH4.5~5.5的檸檬酸緩沖溶液中， 添加纖維素酶和木聚糖酶，在45°C~55°C、150~180rpm條件下，酶解36h~72h，酶解結(jié)束， 對酶解體系進行過濾，除去濾渣，得到酶解液； (2) 以步驟(1)得到的酶解液為發(fā)酵碳源，添加其他營養(yǎng)物質(zhì)后得發(fā)酵培養(yǎng)基， (3) 發(fā)酵條件：菌種初始OD600 3 · 0~6 · 0，溫度30~33°C、搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm，發(fā)酵72 ~120小時。3. 如權(quán)利要求2所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述纖維 素酶添加量為20~40FPU/g木質(zhì)纖維素原料，所述木聚糖酶的添加量為10000~14000U/g木 質(zhì)纖維素原料。4. 如權(quán)利要求2所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述營養(yǎng) 物質(zhì)為:酵母浸粉18~26g/L，K2HP〇4 1.5~3.5g/L，MgS〇4 0.05~0.2g/L。5. 利用權(quán)利要求1所述突變株進行高固木質(zhì)纖維素同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，具 體如下:將木質(zhì)纖維素原料、檸檬酸緩沖液、纖維素酶、木聚糖酶、菌種、營養(yǎng)物質(zhì)同時加入 生物反應(yīng)器中，在溫度33~35°C，搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm條件下，發(fā)酵72~96小時。6. 如權(quán)利要求2所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法或權(quán)利要求5所述的高 固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述木質(zhì)纖維素原料為玉米芯、玉米秸 桿或甜高粱中的一種。7. 如權(quán)利要求5所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述木質(zhì) 纖維素原料按固液質(zhì)量比1:4~1:6投入pH4.5~5.5的檸檬酸緩沖溶液中。8. 如權(quán)利要求5所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述纖維 素酶添加量為10~30FPU/g木質(zhì)纖維素原料，木聚糖酶8000~12000U/g木質(zhì)纖維素原料。9. 如權(quán)利要求5所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述菌種 初始〇D6qq 5.0~8.0。10. 如權(quán)利要求5所述的高固液比木質(zhì)纖維素酶解液發(fā)酵的方法，其特征在于，所述營 養(yǎng)物質(zhì)為:NH4C1 2.87~3.82g/L、KH2P〇4 2.5~4.0g/L、MgS〇4 0.1 ~0.3g/L。
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株經(jīng)過誘變、篩選獲得的可高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的Spathaspora？passalidarum突變株及利用其進行高固木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵的方法。所述突變株克服了現(xiàn)有技術(shù)中菌株乙醇耐受性低、高固形物發(fā)酵難、利用木糖產(chǎn)乙醇能力差的問題，具有較高的溫度耐受性、33℃下發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇濃度達到44.19g/L，利用木質(zhì)纖維素水解液進行葡萄糖木糖共發(fā)酵，乙醇濃度可達到43.26g/L，高固木質(zhì)纖維素同步糖化共發(fā)酵，乙醇濃度可達到49.92g/L。較現(xiàn)有技術(shù)取得了顯著的進步。CGMCC No.1186720151211
【IPC分類】C12P7/06, C12R1/645, C12N1/16
【公開號】CN105505804
【申請?zhí)枴緾N201610027038
【發(fā)明人】陳葉福, 肖冬光, 付更新, 李保忠, 郭學(xué)武
【申請人】天津科技大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月15日