一株高效發(fā)酵木糖的突變株及利用其發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法
【技術領域】：
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域和纖維物質生物轉化技術領域，具體涉及一株經(jīng) 過誘變、篩選獲得的可高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的Spathaspora passalidarum U1-58突變株及 利用U1-58突變株進行高固木質纖維素乙醇發(fā)酵的方法。
【背景技術】：
[0002] 能源、環(huán)保是制約我國經(jīng)濟發(fā)展的兩座大山，尋找可持續(xù)、可再生的清潔能源已成 為我國重要的發(fā)展戰(zhàn)略。乙醇是生物質液體能源的主要存在形式，清潔可再生，是化石燃料 的理想替代品。更重要的是，乙醇還可以為一些化工原料如乙烯等提供原料。木質纖維素因 其來源廣泛、不存在與人爭糧等風險被認為是最具有發(fā)展?jié)摿Φ囊掖忌a(chǎn)原料。近年來，越 來越多的研究者致力于研究以木質纖維素類物質為原料進行乙醇生產(chǎn)。
[0003] 但以木質纖維素類物質為原料生產(chǎn)乙醇依然存在一些挑戰(zhàn)，其中最重要的就是如 何提高乙醇的濃度以此來減小生產(chǎn)過程中的能耗。從經(jīng)濟角度來講，工業(yè)上對乙醇濃度的 最低要求為4% (w/v)。對于纖維素乙醇來說，提高乙醇濃度最常用的辦法就是提高發(fā)酵液 中的固形物含量。提高固形物含量還可以減少發(fā)酵設備的使用，從而降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點。 同步糖化發(fā)酵是高固形物發(fā)酵的基本方法。但高固形物發(fā)酵存在攪拌、傳熱不均勻等難題。 為解決這個難題，研究者們提出了分步糖化發(fā)酵、預酶解、分批補料等策略。雖然這些措施 可以有效地得以實施，但由于木糖發(fā)酵的局限性，在這些策略中高濃度的乙醇主要產(chǎn)自纖 維素組份，木質纖維素中大部分的半纖維素被浪費。
[0004] 木質纖維素類物質中含有30 %~50 %的纖維素和20 %~40 %的半纖維素，而傳統(tǒng) 的釀酒酵母只能發(fā)酵由纖維素酶解而來的六碳糖(葡萄糖），無法發(fā)酵由半纖維素酶解而來 的五碳糖(大部分為木糖）。而天然木糖發(fā)酵酵母又存在乙醇耐受性、抑制物耐受性低等缺 陷。通過代謝工程改造，可使高效發(fā)酵葡萄糖的菌種具有一定的木糖發(fā)酵能力，且此方法在 纖維素乙醇方面也取得了較好的進展，但在葡萄糖存在的情況下，大多數(shù)基因工程菌株的 木糖發(fā)酵速率仍然比葡萄糖低，若想增加木糖利用率，則需要大大延長發(fā)酵時間，發(fā)酵時間 的延長必然導致發(fā)酵效率的降低和成本的增加。所以，我們需要尋找更加適合于木質纖維 素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的菌株。
[0005] 在木糖發(fā)酵酵母中，新型酵母菌株Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907與 其他菌株(Pichia pastoris)相比具有較高的乙醇耐受性、溫度耐受性、滲透壓耐受性等優(yōu) 點。更為重要的是，S. passalidarum在厭氧條件下可進行葡萄糖木糖共發(fā)酵。這些特點使得 S . passalidarum在木質纖維素-生物乙醇轉化方面具有很好的應用潛力。中國專利 201410709989.3公布了一株耐高溫的Spathaspora passalidarum突變株，該突變株在37°C 下?lián)u瓶發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量達到為16.45g/L，30°C，搖瓶發(fā)酵條件下發(fā)酵5天，乙醇濃度達到 39.04g/L，其溫度耐受性提高到41°C，乙醇耐受性提高到12%。但在溫度耐受性及發(fā)酵木糖 產(chǎn)乙醇性能方面仍有待提升。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明在Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907的基礎 上，提供一株高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的突變株，以及利用該突變菌株進行高固液比木質纖維 素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法。
[0007] 所述高效發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的突變株，具體為Spathaspora passalidarum U1-58， 該菌株已于2015年12月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地 址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為 CGMCC No.11867。
[0008] 所述突變株U1-58是以S.passalidarum NRRL Y-27907為出發(fā)菌株，通過等離子誘 變、平板初篩、發(fā)酵復篩，篩選獲得的，該突變株在對溫度的耐受性、發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能 力、葡萄糖木糖共發(fā)酵的能力及高固木質纖維素乙醇發(fā)酵的能力等方面較出發(fā)菌株均有顯 者提尚。
[0009] 利用所述的突變株U1-58進行高固液比木質纖維素酶解液發(fā)酵產(chǎn)乙醇即利用葡萄 糖、木糖共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，具體步驟如下：
[0010] (1)按固液質量比1:4~1:6將木質纖維素原料投入pH4 · 5~5 · 5的檸檬酸緩沖溶液 中，添加纖維素酶和木聚糖酶，在45°C~55°C、150~180rpm條件下，酶解36h~72h，酶解結 束，對酶解體系進行過濾，除去濾渣，得到酶解液；
[0011] 所述纖維素酶添加量為20~40FPU/g木質纖維素原料，木聚糖酶10000~14000U/g 木質纖維素原料；
[0012] 所述木質纖維素原料為玉米芯、玉米秸桿或甜高粱中的一種；
[0013] (2)以步驟（1)得到的酶解液為發(fā)酵碳源，添加適量營養(yǎng)物質后得發(fā)酵培養(yǎng)基，所 述營養(yǎng)物質為:酵母浸粉18~26g/L，K 2HP〇4l · 5~3 · 5g/L，MgS〇4〇 · 05~0 · 2g/L;
[0014] 發(fā)酵條件:菌種初始0D6Q()3.0~6.0，溫度30~33°C、搖床轉速100~150rpm，發(fā)酵72 ~120小時。
[0015] 利用所述突變株U1-58進行高固木質纖維素同步糖化共發(fā)酵產(chǎn)乙醇的方法，具體 步驟如下：
[0016] 將木質纖維素原料、檸檬酸緩沖液、纖維素酶、木聚糖酶、菌種、營養(yǎng)物質同時加入 生物反應器中，在溫度33~35°C，搖床轉速100~150rpm條件下，發(fā)酵72~96小時；
[0017] 所述木質纖維素原料按固液質量比1:4~1:6投入pH4.5~5.5的梓檬酸緩沖溶液 中；
[0018] 所述纖維素酶添加量為10~30FPU/g原料，木聚糖酶8000~12000U/g原料；
[0019] 所述菌種初始0D6QQ5.0~8.0;
[0020]所述營養(yǎng)物質為:NH4C1 2.87~3.82g/L、KH2P〇4 2.5~4.0g/L、MgS〇4 0.1 ~0.3g/ L〇
[0021 ] 有益效果：
[0022] l、Ul-58突變株的溫度耐受性明顯優(yōu)于U1出發(fā)菌株，在溫度在30°C_41°C之間，U1- 58突變株的生長性能與出發(fā)菌株相比均有一定程度的提高。
[0023] 2、U1_58突變株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇性能較U1出發(fā)菌株顯著提高。該突變菌株在41°C 下?lián)u瓶發(fā)酵5天，乙醇濃度、糖醇轉化率分別達到28.50g/L、0.41，分別較U1出發(fā)菌株提高 166.31 %、21.66% ; 37°C下，該突變菌株乙醇濃度、糖醇轉化率分別達到35.41 g/L、0.42，分 別較U1出發(fā)菌株提高72.05%、21.22% ; 33°C下，乙醇濃度及糖醇轉化率分別達到44.19g/ L、0 · 45，分別較U1出發(fā)菌株提高27 · 06%、14 · 25%。
[0024] 3、U1_58突變株進行葡萄糖、木糖共發(fā)酵的能力優(yōu)于U1出發(fā)菌株。該突變菌株利用 木質纖維素水解液進行葡萄糖木糖共發(fā)酵，乙醇濃度可達到43.26g/L，較出發(fā)菌株高出 38.39%。且在葡萄糖存在條件下，U1-58突變株木糖利用速度和木糖利用率顯著提高，木糖 利用率可達到97.12%，較出發(fā)菌株高出57.37%。
[0025] 4、U1_58突變株進行高固木質纖維素乙醇發(fā)酵的能力優(yōu)于U1出發(fā)菌株。33°C下，利 用該突變株和本發(fā)明提供的方法，進行高固木質纖維素同步糖化共發(fā)酵，乙醇濃度可達到 49.92g/L，較U1出發(fā)菌株提高23.41 % ;總糖（纖維素+半纖維素）對乙醇的總轉化率為 0.42g/g，較U1出發(fā)菌株總轉化率高出22.71 % ;纖維素和半纖維素利用率分別達到 86.12%、86·86%，較U1 出發(fā)菌株分別高出4.72%、12.44%。
【附圖說明】：
[0026]圖1 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株37°C下木糖發(fā)酵結果；
[0027]圖2 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株各溫度下生長曲線 [0028] 其中，代表U1出發(fā)菌株；□代表U1-58突變株；
[0029] 圖3 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株各溫度下發(fā)酵性能對比；
[0030] 其中，A為乙醇濃度對比圖，B為木糖濃度對比圖，C為糖醇轉化率對比圖；
[0031 ]圖4 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株玉米芯酶解液發(fā)酵結果
[0032] 其中，A為U1出發(fā)菌株，B為U1-58突變株；
[0033]圖5 U1-58突變株與U1出發(fā)菌株玉米芯同步糖化共發(fā)酵發(fā)酵結果。
【具體實施方式】：
[0034]下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術手段 均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本 發(fā)明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0035] 實施例l:Ul-58突變菌株誘變篩選
[0036] (1)、誘變和初篩以S.passalidarum NRRL Y-27907為出發(fā)菌株（以下簡稱U1菌 株），等離子誘變25s，將誘變后的菌液稀釋至適當濃度，涂布于初篩平板上，37°C倒置培養(yǎng) l-2d后挑取長勢較好、表面光滑的突變株用于復篩。
[0037]初篩平板:木糖50g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，瓊脂20g/L，pH自然。
[0038] (2)、復篩對(1)中所得的突變菌株進行木糖培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵復篩，發(fā)酵培養(yǎng)基為： 木糖100g/L，酵母浸粉22g/L，K2HP〇4 2.5g/L，MgS〇4 0.1g/L。
[0039] 發(fā)酵條件為：裝液量100mL/250mL，菌株初始0D6Q() 1·0，ρΗ 5.5,溫度37°C，轉速 120rpm，發(fā)酵5天。發(fā)酵結束后，高效液相色譜測定發(fā)酵液中木糖、乙醇的含量，并測定發(fā)酵 過程中生物量(菌干重g DCW/L)。篩選出發(fā)酵性能較好的U1-58突變株。U1-58突變株與U1出 發(fā)菌株發(fā)酵過程中各物質變化情況如圖1所示。
[0040] 如圖1可看出，U1-58突變株比出發(fā)菌株對木糖的利用速率快，乙醇產(chǎn)量高，同時菌 株生長速率稍快。U1-58突變株的最大比生長速率為0.081Γ 1，較U1出發(fā)菌株提高33.33%。 U1-58突變株的木糖在84h時基本發(fā)酵完全，乙醇濃度達到35.5g/L，較出發(fā)菌株高出 72.05% ;殘?zhí)橇繛?.5g/L，較出發(fā)菌株低273.33% ;糖醇轉化率達到0.42，較出發(fā)菌株高出 38.82%。其中12h至60h時間段，U1-58突變株乙醇生成速率、木糖消耗速率分別達到達到 0.57g/(L · h)、1.48g/(L · h)，分別較U1 出發(fā)菌株提高67.65%、27.59%·此結果表明，U1-58突變株單位菌體發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇性能優(yōu)于U1出發(fā)菌株單位菌體發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇性能。
[0041] 實施例2:不同溫度下U1-58突變株與U1出發(fā)菌株生長性能的測定
[0042] 以U1-58突變株和U1出發(fā)菌株互為對照，在30°(3、33°(3、35°(3、37°(3、39°(3和41°(3