K至50ml離心管。
[0047] (2)加 3ml血漿至離心管。
[0048] (3)加 2.4ml carrier-ACL mix至離心管，蓋好管帽，禍旋振蕩30s混勾。
[0049] (4)將離心管放到水浴箱中60°C孵育30min。
[0050] (5)從水浴箱中取出離心管，旋開(kāi)管蓋。加入5.4ml ACB緩沖液至離心管，關(guān)閉管 蓋，渦旋震蕩20s，充分混勻。
[0051] (6)將離心管置于冰上孵育10min。由于熒光實(shí)時(shí)定量PCR需要參照，血清循環(huán)RNA 檢測(cè)過(guò)程中無(wú)公認(rèn)可靠的內(nèi)參基因（管家基因），因此我們選擇往3ml血漿中加入lng無(wú)關(guān)質(zhì) 粒pGL3 (購(gòu)自Promega公司）作對(duì)照。
[0052] (7)采用真空抽吸方法純化血清核酸(包括血清中的RNA及加入的pGL3質(zhì)粒DNA): 組裝好20ml延長(zhǎng)管，mini柱和真空連接器，打開(kāi)真空栗，待到全部裂解液通過(guò)mini柱(約10 分鐘），關(guān)閉真空栗，將壓力釋放到〇,卸下并丟棄延長(zhǎng)管。
[0053] (8)加600ul ACW1緩沖液到mini柱，維持mini柱蓋子呈打開(kāi)狀態(tài)，打開(kāi)真空栗，待 到ACW1完全通過(guò)mini柱，關(guān)閉真空栗，將壓力釋放到0。（第一遍洗滌，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0054] (9)加750ul ACW2緩沖液到mini柱，維持mini柱蓋子呈打開(kāi)狀態(tài)，打開(kāi)真空栗，待 到ACW2完全通過(guò)mini柱，關(guān)閉真空栗，將壓力釋放到0。（第二遍洗滌，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0055] (10)加750ul 100%乙醇至mini柱，維持mini柱蓋子呈打開(kāi)狀態(tài)，打開(kāi)真空栗，待 到乙醇完全通過(guò)mini柱，關(guān)閉真空栗，將壓力釋放到0。（第三遍洗滌，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0056] (11)關(guān)閉mini柱的蓋子，將mini柱卸下來(lái)，丟棄連接器，將mini柱放到干凈的2ml 收集管，20，000x g離心3min。（去除殘留的乙醇）
[0057] (12)將mini柱放到一個(gè)新的2ml收集管，打開(kāi)管蓋，放到水浴箱中56°C孵育lOmin， 直到mini膜完全干燥。將mini柱放到一個(gè)干凈的1.5ml洗脫管，丟棄上一步的2ml收集管，加 入20ul AVE緩沖液(不含carrier RNA)至mini膜的中央，關(guān)上蓋子，室溫孵育3min。20，000x g離心lmin，洗脫純化的核酸。
[0058] lyg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量ΡΟ^ΜΧ：284454正向引物為5'-ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 ' 如SEQ Ν0:6所示，和反向引物5 ' -ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3 ' 如 SEQN0:7**。
[0059] 用于對(duì)照的質(zhì)粒pGL3中螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的正向引物為
[0060] 5 ' -TCCATCTTGCTCCAACACCC-3 ' 如SEQ N0:8所示，和反向引物
[0061 ] 5 ' -TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3 '，如SEQ N0:9所示。
[0062] 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，取cDNA為模板，加入SEQ ID N0:6、7、8、9所示的引物以及PCR 反應(yīng)液，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)樣本閾值Cq;同時(shí)，pGL3質(zhì)粒DNA液10倍梯度稀釋?zhuān)鳛樾?duì)樣 本，在每個(gè)PCR反應(yīng)板中進(jìn)行檢測(cè)，記錄Cq值；內(nèi)參pGL3質(zhì)粒PCR擴(kuò)增；
[0063]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系 iTaq1 vl Universal SYBR? Green Super Mix 5 μL PCR Forward Pri.mer ?'ΙΟμηι.) 0.5μL PCR Reverse Primer < lOum) 0.5μΙ
[0064] cDNA 模板 2.0μΙ dH20 2 μL Total 10 μΙ
[0065] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟 1 9SV 30 see 2 95 V 5 sec
[0066] 3 60Γ 30 see 4 Go to stop 2 (or more 35 limes 5 Perform melting curve from 55.0 C lo 95.0'C , read every 0.2'C , hold for 1 see
[0067] 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):上述檢測(cè)完成后，拷貝數(shù)以10為底取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Cq值為縱坐 標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算斜率S，然后根據(jù)公式E = 10(_1/s)-l，計(jì)算擴(kuò)增效率E;
[0068] 計(jì)算:選中樣本和校對(duì)樣本檢測(cè)孔，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的隨機(jī)軟件得出樣本 閾值Cq(T)和校對(duì)樣本閾值Cq(C)，根據(jù)公式Q=(E+lΓ Λeq，ΛCq=[Cq(T)-Cq(C)]，得出基因 的校正起始拷貝數(shù)Q;將L0C284454的Q值與pGL3質(zhì)粒的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到 L0C284454的相對(duì)表達(dá)量，采用unpaired t-test檢驗(yàn)計(jì)算P值。
[0069] 2.結(jié)果
[0070] L0C284454在正常人血清中不表達(dá)或者表達(dá)很低，而在鼻咽癌患者血清中高表達(dá)P 〈0.001(圖2)。
[0071]實(shí)施例3,原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中的表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)
[0072] 1.材料方法
[0073] 1.1設(shè)計(jì)并合成雜交探針
[0074]為了采用原位雜交方法檢測(cè)L0C284454的表達(dá)情況，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)原位雜交檢 測(cè)L0C284454表達(dá)的寡核苷酸探針及陽(yáng)性對(duì)照兩組原位雜交寡核苷酸探針各3條。
[0075]用于原位雜交檢測(cè)L0C284454表達(dá)的寡核苷酸探針：
[0076] L0C284454探針1:5 ' -GACCGGAAAATAACAAACAAAAACTCTGCCTCAG-3 ' 如SEQ N0:10所 示，
[0077] L0C284454探針2:5 ' -GTGATAGAACTTTAGTCTACCCTCCTCCGAAAAA-3 ' 如SEQ NO: 11所 示，
[0078] L0C284454探針3:5'-GTACAGACAACAAGTTCATTTATTTTCAACGGGAC-3'如SEQ N0:12所 不。
[0079]陽(yáng)性對(duì)照探針(檢測(cè)看家基因 GAPDH):
[0080] GAPDH探針1:5，-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3，，如SEQ N0:13所示，
[0081 ] GAPDH探針2:5，-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3，，如SEQ N0:14所示，
[0082] GAPDH探針3:5，-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3，，如SEQN0:15所示。
[0083] 采用化學(xué)合成方法合成上述設(shè)計(jì)的各基因特異性寡核苷酸探針序列。
[0084] 1.2寡核苷酸探針標(biāo)記試劑盒和原位雜交檢測(cè)試劑
[0085] 地高辛寡核苷酸加尾試劑（Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物檢測(cè)試劑盒(Anti-Digoxigenin-P0D，F(xiàn)ab fragments，Roche公司），增強(qiáng)原位表達(dá)檢測(cè)信號(hào)的TSA信號(hào)放大系統(tǒng)（TSA? Biotin System，NEL700試劑盒，PerkinElmer公司），DAB染色試劑盒(北京中山公司），20x檸檬酸鈉 緩沖溶液（saline sodium citrate，SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去離子甲酰胺 (Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸 (polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，變性剪切的娃精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(yeast t_RNA，tRNA)，二硫蘇糖醇（DTT)，50x鄧罕 氏緩沖液(Denhardts's solution)，磷酸緩沖液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白 (BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.05%Tween 20)，醋酸酐，阻 斷試劑（Blocking reagent agent，Roche公司）。
[0086] 1.3其他主要試劑和材料
[0087] 無(wú)水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松節(jié)油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2~ 7 · 4，NaCl 137mmo 1 /L，KC1 2 · 7mmo 1 /L，Na2HP〇44 · 3mmo 1 /L，KH2PO41 · 4mmo 1 /L); 3 % 甲醇-雙 氧水溶液(80%甲醇和30%雙氧水配置）；0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer，CB， ?冊(cè).0±0.1，911110.說(shuō)檸檬酸溶液和4111110.謂梓檬酸鈉溶液加入4501111蒸餾水中臨時(shí)配置 后再校正工作液pH值）；0.1 %胰蛋白酶;蘇木素；1 %鹽酸酒精（1ml濃鹽酸+99ml 70 %酒精 配置）；封片膠(PTS Cure 1〇111^11);專(zhuān)用蓋玻片（480\24〇1111112)定制于鄭州玻璃儀器廠(chǎng)。 Leica低熔點(diǎn)（58°C)石蠟，國(guó)產(chǎn)蜂蠟，無(wú)水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛(0.01m〇l/L， pH7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制），蘇木素，伊紅，中性封片樹(shù)膠，蓋玻片，載玻片。
[0088] 1.4標(biāo)記探針
[0089] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進(jìn)行寡核苷酸探針標(biāo)記，反應(yīng)體系如 下。
[0090] lOOpmol oligonucleotide+ddH2〇 = 9yl(control: control oligonucleutide 5μ l+ddH20 4μ1) Reaction buffer 4μ1 Cocli 4μ1
[0091 ] Dig-dUTP ΙμL dATP 1μ1 Terminal transferase ΙμL
[0092] 混勻，稍離心。37°C水浴反應(yīng)30min，加2μ1 EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反應(yīng)。
[0093] 1.5寡核苷酸探針標(biāo)記后純化
[0094]為了增加標(biāo)記探針的純度，需對(duì)已標(biāo)記的探針進(jìn)行純化，具體操作如下：
[0095] 1)探針?lè)磻?yīng)混合物（22μ1)+2·5μ1 4M LiCL+75yl 100%冷乙醇（_20°C).
[0096] 2) -70°C 沉淀 60min，or-20°C2h。
[0097] 3)13.000Xg 4°C離心15min。
[0098] 4)棄上清，用50μ1冰冷的70% (V/V)乙醇洗滌。
[0099] 5)13.000xg 4°C，離心5min。
[0100] 6)棄上清，真空4°C干燥。
[0101 ] 7)用無(wú)菌雙蒸水重溶探針。
[0102] 1.6原位雜交檢測(cè)存檔石蠟切片中L0C284454的表達(dá)
[0103]石蠟切片雜交前處理
[0104] 1)4°C保存的石蠟切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蠟。
[0105] 2)二甲苯依次脫蠟3X5min。
[0106] 3)梯級(jí)酒精洗滌，100% 酒精 2X2m