檢測(cè)鼻咽癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼rna loc284454表達(dá)量的試劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測(cè)鼻咽癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C284454表達(dá)量的試劑用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類基因組計(jì)劃及其后續(xù)的DNA元件百科全書計(jì)劃（The Encyclopedia of DNA Elements Project，ENC0DE)研究成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉(zhuǎn)錄的序列為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, IncRNAhLncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復(fù)雜程度的升高，基因組中IncRNA 序列的比例也相應(yīng)地增大，提示IncRNA在生物進(jìn)化過(guò)程中有重要意義。隨著IncRNA不斷被 發(fā)現(xiàn)，它們的功能逐漸被詮釋，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動(dòng)不同層 面的功能調(diào)控中，作為一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，已經(jīng)成為國(guó)際生命科學(xué)研究領(lǐng)域新的前沿與熱點(diǎn)。 [000 3] LncRNA可作為功能蛋白質(zhì)的信號(hào)（signal)、誘導(dǎo)（guide)、誘t耳（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質(zhì)重構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調(diào)控基 因的表達(dá)，并在包括發(fā)育、免疫、生殖等基本生理過(guò)程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達(dá)與功能失調(diào)已經(jīng)與包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病緊密聯(lián)系在了一 起。因此，深入研究IncRNA的功能，揭示由IncRNA介導(dǎo)的遺傳信息傳遞方式和表達(dá)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結(jié)構(gòu)與功能，深入發(fā)現(xiàn) 生命活動(dòng)的本質(zhì)和規(guī)律，還有望從一個(gè)新的視角認(rèn)識(shí)包括腫瘤在內(nèi)的多種人類常見疾病的 發(fā)病機(jī)理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)。
[0004] 鼻咽癌是常見高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤，容易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。研究 表明，這種腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，LncRNA在鼻咽癌的 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能也起到了重要的作用。最近我們發(fā)現(xiàn)IncRNA L0C284454(NCBI accession number :NR_036515)在鼻咽癌組織和血清中表達(dá)上調(diào)，針對(duì)該IncRNA的檢測(cè)制 劑也可以用于鼻咽癌的輔助診斷。我們進(jìn)一步增加樣本，在112例有臨床隨訪資料的鼻咽癌 石錯(cuò)存檔標(biāo)本中，通過(guò)原位雜交（in situ hybridization)的方法檢測(cè)了L0C284454的表達(dá) 水平，發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)L0C284454的鼻咽癌患者比低表達(dá) L0C284454的鼻咽癌患者預(yù)后差，因此針對(duì)該IncRNA的檢測(cè)制劑也可以用于鼻咽癌的預(yù)后 判斷。
[0005] 我們通過(guò)設(shè)計(jì)并合成靶向L0C284454的短發(fā)夾RNA(short-hairpin RNA，shRNAs) 序列，構(gòu)建了靶向L0C284454的RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染到鼻咽癌細(xì)胞株中，在體外培養(yǎng)系統(tǒng)和裸 鼠轉(zhuǎn)移瘤體內(nèi)模型中均證實(shí)靶向干擾L0C284454的表達(dá)可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn) 移能力。將L0C284454的RNA干擾載體負(fù)載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納米基因 轉(zhuǎn)運(yùn)體，多聚賴氨酸修飾的硅納米顆?？杀Ｗo(hù)L0C284454的RNA干擾載體免受核酸酶降解， 延長(zhǎng)作用時(shí)間，且有更高的轉(zhuǎn)染效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供檢測(cè)鼻咽癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C284454表達(dá)量的試劑用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑的用途。
[0007] 檢測(cè)鼻咽癌組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C284454表達(dá)量的試劑的應(yīng)用，所述的試劑 用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑；該長(zhǎng)鏈非編碼RNA L0C284454的序列如SEQ NO: 1所示。
[0008] 所述的鼻咽癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)制劑為實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑。
[0009] 所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑中包含用于實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)L0C284454表達(dá)的引 物序列：
[0010] 正向引物：5'-17(：0^6〇八60^67^〇0：-3'，
[0011 ]反向引物:5 ' -CTCCCGGCAAGTTAGAAAGC-3 '。
[0012]所述的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑中包含用于對(duì)照的GAPDH正向引物5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 和反向引物5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了IncRNA L0C284454在鼻咽癌(27例)和慢 性炎癥鼻咽上皮組織(9例）中的表達(dá)情況，L0C284454表達(dá)顯著上調(diào)(P = 0.0056)。為鼻咽癌 的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)情況；
[0015] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證IncRNA L0C284454在鼻咽癌(27例)和慢性炎癥鼻咽上 皮組織(9例）中的表達(dá)情況，L0C284454表達(dá)顯著上調(diào)(P = 0.0056);
[0016] 圖2為L(zhǎng)0C284454在鼻咽癌患者血清中同樣表達(dá)上調(diào)情況；
[0017] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)lncRNAL0C284454在鼻咽癌患者血清(77例）和正常人 血清（14例）中的表達(dá)情況;L0C284454在鼻咽癌患者血清中的表達(dá)比正常人血清中顯著提 尚。
[0018]圖3為原位雜交檢測(cè)L0C284454在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達(dá)情況；
[0019] L0C284454在正常鼻咽上皮(NPE)中表達(dá)水平較低，40例正常鼻咽上皮中僅有6例 (15% )中檢測(cè)到有L0C284454的低表達(dá)，在其余34例中檢測(cè)不到；而在112例鼻咽癌組織中 有89例鼻咽癌（79.5%)中檢測(cè)到有L0C284454的表達(dá)，其中71例為高表達(dá)，18例為低表達(dá)， 其余的23例鼻咽癌組織中未檢測(cè)到L0C284454的表達(dá);P〈0.001。
[0020]圖4為鼻咽癌組織中L0C284454高表達(dá)患者預(yù)后差，更易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；
[0021] 鼻咽癌中L0C284454的高表達(dá)與鼻咽癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，即L0C284454高表達(dá) 的患者總的生存時(shí)間（Over-all survival，0S)和無(wú)病生存時(shí)間（Deases-free sruvival， DFS)要明顯低于L0C284454低表達(dá)或不表達(dá)的患者。L0C284454在鼻咽癌(NPC)中的表達(dá)與 患者復(fù)發(fā)(C)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(D)密切相關(guān)，L0C284454表達(dá)高的患者更容易復(fù)發(fā)，L0C284454遠(yuǎn) 處轉(zhuǎn)移的能力更強(qiáng)。
[0022] 圖5為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入L0C284454的干擾載體，可顯著抑制L0C284454在鼻咽 癌細(xì)胞中的表達(dá)；
[0023] 在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HNE2和HK1中導(dǎo)入靶向L0C284454的干擾載體（sh-l，sh-2， sh-3)后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了鼻咽癌細(xì)胞中L0C284454的表達(dá)情況，L0C284454的 表達(dá)均受到明顯的抑制。陰性對(duì)照(NC)為Scramble干擾載體。
[0024] 圖6為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入L0C284454的干擾載體抑制L0C284454表達(dá)后，細(xì)胞侵 襲能力降低；
[0025] 細(xì)胞穿膜（讓&118￥611)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8?、!1呢2和服1中轉(zhuǎn)入靶向 L0C284454的干擾載體，抑制L0C284454的表達(dá)后，能穿過(guò)基質(zhì)膠膜的鼻咽癌細(xì)胞數(shù)目顯著 減少，表明細(xì)胞侵襲能力降低。
[0026] 圖7為在鼻咽癌細(xì)胞中導(dǎo)入L0C284454的干擾載體抑制L0C284454表達(dá)后，細(xì)胞迀 移能力降低；
[0027] 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞系5-8F、HNE2和HK1中轉(zhuǎn)入靶向L0C284454的干 擾載體，抑制L0C284454的表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移速度明顯減慢， 劃痕愈合的時(shí)間延長(zhǎng)，表明細(xì)胞運(yùn)動(dòng)迀移能力降低。
[0028]圖8為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)干擾L0C284454的表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力； [0029] 在鼻咽癌細(xì)胞5-8F中轉(zhuǎn)入shRNA干擾載體抑制L0C284454表達(dá)后，經(jīng)尾靜脈將鼻咽 癌細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組(NC)相比，shRNA敲低L0C284454表 達(dá)的5-8F細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目變少（圖8A、C)，轉(zhuǎn)移灶的體積變?。▓D8B、D)，P〈0.05，表明鼻 咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力受到明顯抑制。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0031] 實(shí)施例1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中表達(dá)上調(diào) [0032] 1.材料與方法：
[0033] 收集9例慢性鼻咽上皮組織和27例鼻咽癌組織，抽提總RNA，lyg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量ΡΟ^υΧ284454正向引物為5'-TTCCTAGCAGCCAGTTACCC-3'如SEQ N0:2所示，和反向引物5 ' -CTCCCGGCAAGTTAGAAAGC-3 ' 如SEQ N0:3所示。
[0034]用于對(duì)照的GAroH正向引物為5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ' 如SEQ N0:4所示，和 反向引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如SEQ N0:5所示。
[0035]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系 SYBR? Premix Ex Taq? (2>< 5 10μ1 PCR Forward Primer ( ΙΟμτη) 0.4μ1 PCR Reverse Primer (lOutn - 0·4μΙ
[0036] eDNA 模板 2.0μ1 dH20 7.2μ] Total 20μ1
[0037] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)步驟 1 94V 5 min 2 (-)5 '0 10 see 3 58DC 30 sec 4 72 °C 20 sec
[0038] 5 Plate read 6 82 °C 30 see 7 Elate read 8 Go lo step 2 for more 39 limes 9 Perferm melting curve from 55,0? to 95.0°C, read every 0.2?, hold for 1 see
[0039] 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根 據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test檢驗(yàn)計(jì)算 P值。
[0040] 2.結(jié)果
[0041 ] L0C284454在正常對(duì)照組織中不表達(dá)或者表達(dá)很低，而在鼻咽癌組織中高表達(dá)P〈 0.001(圖 1)
[0042] 實(shí)施例2,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)證實(shí)L0C284454在鼻咽癌患者血清中表達(dá)上調(diào)
[0043] 1.材料與方法：
[0044]使用BD 10ml血漿采集管(EDTA抗凝管)采集收集14例正常人和77例鼻咽癌患者靜 脈空腹血約8ml，輕輕顛倒3次，lh內(nèi)離心，X 160(^，1〇111；[11，4°0;冰上小心吸取上層血衆(zhòng)至新 的離心管，編號(hào)、標(biāo)記，_80°C保存。
[0045] 血衆(zhòng)中抽提總RNA利用血衆(zhòng)核酸抽提試劑盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Catalog no.55114，Qiagen公司）抽提，具體步驟如下：
[0046] (1)吸取300ul蛋白酶