性溫度可以設(shè)置為92-98°C，變性時(shí)間可以設(shè)置為35-45s。
[0030] 同樣地，在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述PCR擴(kuò)增過(guò)程的退火溫度可以選 擇為55-60°C，退火時(shí)間可以選擇為25-35s。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述所述的多重PCR引物或上述所述的方法在鑒定安吉 小銳(Hynobius amjiensis)中的應(yīng)用。
[0032] 以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，所述引物均由上海生 工生物工程技術(shù)有限公司合成且引物濃度為10pm 〇l/L，所述裂解液可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用 的DNA裂解液，例如，在本發(fā)明中，每升所述裂解液中含有50mmol的Tris-HCl(pH8.0)、 25mmo 1的乙二胺四乙酸(pH8.0)、lOOmmo 1的氯化鈉和1 %重量份的十二烷基硫酸鈉，本發(fā)明 中使用的dNTPMix為T(mén)ransgene公司的市售品，蛋白酶K為Merck公司的市售品，所述DNA純化 試劑盒為T(mén)iangen公司的市售品，其余所使用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售分析純?cè)噭?br>[0033] 實(shí)施例1
[0034]將0.5g表1中編號(hào)為1的待測(cè)樣品置于離心管中并在離心管中將待測(cè)樣品用消毒 剪刀剪碎，然后向離心管中依次加入500yL的裂解液，30yL的10%十二烷基硫酸鈉和3以1^勺 20mg/ml的蛋白酶K，充分混勻后56°C水浴消化12h至管內(nèi)液體澄清。向上述消化后的混合物 中加入Tris-平衡酸500yL，并輕微振蕩5min后置于11000r/min的離心機(jī)上離心10min，取離 心后的上清液。重復(fù)上述離心步驟兩次。向重復(fù)離心后最終得到的上清液中加入冰凍無(wú)水 乙醇1000yL并于-20°C下放置lh后置于12000r/min的離心機(jī)上離心13min后，棄上清液，并 向得到的沉淀中加入70%的乙醇80(^1^，并輕微振蕩0.5111；[11后置于130001'/111；[11的離心機(jī)上 冰凍離心13min，棄上清液。重復(fù)上述離心步驟兩次。將得到的沉淀置于無(wú)菌操作臺(tái)上自然 晾干2.5h后向其中加入TE溶液400yL，輕微振蕩并用手指輕彈離心管后于4°C下放置3h后進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳，得到總DNA。
[0035] 向PCR儀的樣品管中加入10yL的10XPCR buffer，每條引物各lyL，2yL的2mmol/L 的dNTPMix，2yL的25mmol/L的Mg2+，1U的Taq酶和50ng的總DNA，并用雙蒸水補(bǔ)齊至30μΙ^ΡΟ? 反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，該循環(huán)包括:95°C變性40s，58°C退火30s 和72°C延伸35s;最后再作72°C延伸10min。在上述反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示(泳道編號(hào)為1)。
[0036] 實(shí)施例2
[0037] 按照實(shí)施例1的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為2,且每條引物的 用量為0.6yL，總DNA的用量為40ng，變性溫度為92°C，變性時(shí)間為35s，退火溫度為55°C，退 火時(shí)間為25s，電泳結(jié)果如圖1所示(泳道編號(hào)為2)。
[0038] 實(shí)施例3
[0039] 按照實(shí)施例1的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為3,且每條引物的 用量為1.5yL，總DNA的用量為60ng，變性溫度為98°C，變性時(shí)間為45s，退火溫度為60°C，退 火時(shí)間為35s，電泳結(jié)果如圖1所示(泳道編號(hào)為3)。
[0040] 對(duì)比例1
[0041] 按照實(shí)施例1的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為C，電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為C)。
[0042] 對(duì)比例2
[0043] 按照實(shí)施例1的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為4,電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為4)。
[0044] 對(duì)比例3
[0045] 按照實(shí)施例1的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為5,電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為5)。
[0046] 對(duì)比例4
[0047] 按照實(shí)施例2的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為6,電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為6)。
[0048] 對(duì)比例5
[0049] 按照實(shí)施例2的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為7,電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為7)。
[0050] 對(duì)比例6
[0051] 按照實(shí)施例2的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為8,電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為8)。
[0052] 對(duì)比例7
[0053] 按照實(shí)施例3的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為9,電泳結(jié)果如圖 1所示(泳道編號(hào)為9)。
[0054] 對(duì)比例8
[0055] 按照實(shí)施例3的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為10,電泳結(jié)果如 圖1所示(泳道編號(hào)為10)。
[0056] 對(duì)比例9
[0057] 按照實(shí)施例3的制備方法進(jìn)行制備，不同的是，待測(cè)樣品的編號(hào)為11，電泳結(jié)果如 圖1所示(泳道編號(hào)為11)。
[0058] 測(cè)試?yán)?br>[0059]將得到兩條條帶的含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊用干凈的手術(shù)刀切膠后并在 DNA純化試劑盒中進(jìn)行純化后送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0060] 表 1
[0061]
[0062]
[0063] 通過(guò)表1的樣品信息及圖1的電泳圖結(jié)果比對(duì)可以看出，通過(guò)本發(fā)明設(shè)計(jì)的兩對(duì)引 物對(duì)，在實(shí)際檢測(cè)時(shí)可以將待測(cè)樣品僅通過(guò)一次PCR擴(kuò)增并通過(guò)凝膠糖電泳實(shí)驗(yàn)中的電泳 圖結(jié)果即可判斷待測(cè)樣品是否為安吉小鯢，不僅檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，而且實(shí)際使用時(shí)更 為經(jīng)濟(jì)而高效。而且送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序的DNA片段的序列，長(zhǎng)度 均為約 150bp(GenBank 登錄號(hào)分別為 KU218709，KU218710 和 KU218711)，利用 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù) 的Blast軟件搜索比對(duì)后顯示，3個(gè)安吉小鯢樣品的DNA序列與GenBank中已有的安吉小鯢物 種線粒體Cyt b基因同源片段序列（登錄號(hào)JQ929949.1)的序列相似性均為98%以上，進(jìn)一 步證實(shí)了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)所采用的待測(cè)樣品可以為成體肌肉，可以為蝌蚪肌 肉，也可以為卵帶，大大提高了其適用范圍，降低了取樣的難度。
[0064] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這 些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0065] 另外需要說(shuō)明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說(shuō)明。
[0066] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于鑒定安吉小鯢(Hynobiusamjiensis)的多重PCR引物，其特征在于，所述多 重PCR引物包括如SEQIDNo:l和SEQIDNo:2所示的引物對(duì)l，以及如SEQIDNo:3和SEQ IDNo:4所示的引物對(duì)2。2. -種利用多重PCR鑒定安吉小鯢(Hynobius amjiensis)的方法，其特征在于，所述方 法包括： 1) 提取待測(cè)樣品的總DNA; 2) 采用根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR引物對(duì)步驟1)中提取的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3) 將步驟2)中得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè);其中， 在步驟3)中所得到的瓊脂糖凝膠電泳圖中，若含有步驟2)中得到的產(chǎn)物的泳道中出現(xiàn) 2條條帶，則判斷所述待測(cè)樣品為來(lái)自安吉小鯢的樣品，若含有步驟2)中得到的產(chǎn)物的泳道 中不出現(xiàn)2條條帶，則判斷所述待測(cè)樣品不是來(lái)自安吉小鯢的樣品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，出現(xiàn)的2條條帶中所含有的DNA片段的長(zhǎng)度分別為 150bp和425bp。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，相對(duì)于30yL的PCR擴(kuò)增體系的總體積，每條引物的 濃度為〇. 2-0.5pmol/L，DNA模板的用量為40-60ng。5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增過(guò)程的變性溫度為92-98°C，變性時(shí)間為35-45s。6. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述PCR擴(kuò)增過(guò)程的退火溫度為55-60°C，退火時(shí)間為25-35s。7. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重PCR引物或權(quán)利要求2-6任意一項(xiàng)所述的方法在鑒定 安吉小鯢(Hynobiusamjiensis)中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于鑒定安吉小鯢(Hynobius？amjiensis)的多重PCR引物和方法及應(yīng)用，其中，所述多重PCR引物包括如SEQ？ID？No：1和SEQ？ID？No：2所示的引物對(duì)1，以及如SEQ？ID？No：3和SEQ？ID？No：4所示的引物對(duì)2。通過(guò)上述方案，從安吉小鯢成體、蝌蚪或是卵帶等組織中提取其DNA，利用本發(fā)明提供的兩對(duì)PCR引物對(duì)，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中是否出現(xiàn)兩條條帶來(lái)對(duì)安吉小鯢進(jìn)行特異性鑒定，避免了常規(guī)DNA測(cè)序及序列比對(duì)等繁瑣步驟，實(shí)現(xiàn)了僅需通過(guò)一次PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)即可鑒定安吉小鯢，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便且實(shí)際使用時(shí)更為經(jīng)濟(jì)而高效的效果。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105441547
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510970193
【發(fā)明人】晏鵬, 王明勝, 吳孝兵
【申請(qǐng)人】安徽師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日