雞mmp13基因5′調(diào)控區(qū)兩個突變位點的分子標記方法及其在雞育種中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了一種雞MMP13基因5'調(diào)控區(qū)的兩個突 變位點的分子標記方法及其育種中的應用。
【背景技術】
[0002] 胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs)與其相關的內(nèi)生性抑 制劑共同構成MMP系統(tǒng)，參與細胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix,ECM)重塑的調(diào)節(jié)諸如細 胞增殖、顆粒細胞分化及卵巢血管化結構的形成和降解等過程。MMP13亦稱膠原酶3,能夠 切割纖維和非纖維膠原。其能夠催化纖維膠原蛋白三股螺旋的關鍵結構域，使得膠原蛋白 的穩(wěn)定性和溶解性發(fā)生變化。Balbinetal(1996)和Huangetal(1999)研究表明，MMP13 參與大鼠發(fā)情周期調(diào)節(jié)，尤其是在胚胎著床期起重要作用，是參與卵巢功能調(diào)節(jié)的主要金 屬蛋白酶；朱桂玉（2014)等通過高通量測序發(fā)現(xiàn)MMPs家族在白來航雞開產(chǎn)前后卵巢中存 在差異，其中包括MMP13基因。
[0003] 分子標記輔助選擇育種，是在分子水平上對目標性狀進行選擇，可以不受環(huán)境影 響，通過遺傳背景選擇，減少連鎖累贅，從而加速育種過程及精準度?；虮磉_是生命過程 中的細胞把儲存在DNA序列上的遺傳信息經(jīng)過轉錄和翻譯，轉變成蛋白質(zhì)的過程。其中，轉 錄受5'調(diào)控區(qū)序列的調(diào)控，其堿基突變通常會影響轉錄的起始，從而影響基因的表達。因 此，研究雞MMP13的5'調(diào)控區(qū)的SNPs，有助于找到有意義的分子標記，為雞的標記輔助選 擇育種提供有利的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 根據(jù)現(xiàn)有技術，發(fā)明人進行了進一步的研究和實驗，具體涉及了 一種雞MMP13 基因5'調(diào)控區(qū)突變位點的分子標記方法及其育種中的應用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雞MMP13 5' 調(diào)控區(qū)存在 6 個突變位點，即-1719(T>C)、-1661(C>A)、-1356(G>A)、-1128(A>G)、-10 94 (C>A)和-1079 (T>C)位點，并用SHEsis在線軟件進行了連鎖不平衡分析，結果發(fā) 現(xiàn)-1719和-1661、-1356和-1128、-1094和-1079位點分別呈現(xiàn)完全連鎖狀態(tài)。因此， 取-1719、-1356和-1079位點進行單個位點標記分析，結果發(fā)現(xiàn)-1356和-1079位點均與 開產(chǎn)日齡相關，AC/AC基因型的開產(chǎn)日期顯著早于GT/GT和GT/AC基因型。可見檢測這兩 個與產(chǎn)蛋性狀相關聯(lián)的分子標記，不僅方法簡便快速，并且有助于選育高產(chǎn)蛋的雞種，為育 種工作提供有利的幫助。
[0005] 本發(fā)明的具體標記方法是：
[0006] 采用標記引物P-MMP13，包括
[0007]P-MMP13-F，其序列如SeqIDNo:l所示；
[0008]P-MMP13-R，其序列如SeqIDNo:2 所示；
[0009] 擴增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到 的序列如SeqIDN〇:3所示，結果檢測到存在6個突變位點，即-1719(T>C)、-1661(C>A)、-1 356 (G>A)、-1128 (A>G)、-1094 (C>A)和-1079 (T>C)位點。
[0010] 在開產(chǎn)晚的群體中，選擇GT/AC基因型個體的公母雞通過相互交配得到AC/AC基 因型個體的后代，然后對AC/AC基因型個體進行繁育擴群，即可以得到全為AC/AC基因型開 產(chǎn)早的群體。
[0011] 通過這種標記方法得到的AC/AC基因型種雞能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，在產(chǎn)蛋性 能低的地方品種中有意增加AC/AC基因型的頻率對提尚廣蛋量是一個有效措施，而對于開 產(chǎn)較晚的群體，這樣的措施會使其開產(chǎn)適當提前，從而實現(xiàn)早期選種。 (四）
【附圖說明】
[0012] 圖1為P-MMP13-F/R引物PCR擴增的片段電泳圖，
[0013]圖 2 為雞MMP13 5' 調(diào)控區(qū)-1719(T>C)、-1661(C>A)、-1356(G>A)、-1128(A>G)、-1 094 (C>A)和-1079 (T>C)位點的多態(tài)性測序圖；
[0014] 圖3為隱性白洛克雞中6個多態(tài)位點的連鎖不平衡關系圖；
[0015] 圖4為構建點突變pGL3_載體后序列比對結果；
[0016] 圖5為wt-MMP13和mut-MMP13兩種基因型雙熒光素酶報告基因啟動活性檢測示 意圖； (五）
【具體實施方式】
[0017] 實施例1雞MMP13 5'調(diào)控區(qū)序列比對及多態(tài)性位點分析
[0018]1.試驗材料
[0019] 隱性白洛克雞（山東紀華家禽育種有限公司），隨機采樣，翅靜脈采血，提取基因 組后，-20 °C保存。
[0020] 2.試驗方法
[0021] 2.1引物設計
[0022] 根據(jù)已發(fā)表紅色原雞序列（GenBankAccessionNC_006088. 3)設計引物 P-MMP13(其序列詳見表1及SeqIDNo:l和2)，此引物是為研究雞MMP13 5'調(diào)控區(qū)的突 變而根據(jù)數(shù)據(jù)庫中登錄的紅色原雞的序列特意設計的。
[0023] 2. 2PCR擴增
[0024] 隨機選取36只隱性白洛克雞基因組，用引物P-MMP13進行PCR擴增。引物 見表 1，反應體系 20yL，其中包括lyL基因組DNA(50-100ng)，2yL10XEx-buffer， 1.6卩1^(1贈8(2.511116&。11，丁&1^1^)，上下游引物各0.4卩"10卩]\1)，0.1卩1^叉-丁&1〇熟 polymerase(5U/yL，TaKaRa)，ddH20 補足至 20yL。擴增程序：94°C預變性 5min;94°C變性 30sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，進行35個循環(huán)；循環(huán)結束72°C孵育5min。
[0025] 將36只個體的PCR擴增產(chǎn)物隨機混合分為6組，進行瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖 凝膠回收試劑盒（AxyPrepDNAGelExtractionKit，AXYGEN)進行回收，送濟南博尚生物 技術公司測序。
[0026]表1引物的序列、位置和退火溫度
[0027]
[0028] 3.結果與分析
[0029]PCR產(chǎn)物電泳見附圖1，目的片段804bp。
[0030] 使用DNAMANversion7. 0比對序列同源性和完成突變核苷酸的檢索，用 ChromasPro軟件對測序結果分析，發(fā)現(xiàn)擴增的隱性白洛克雞MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1719(T>C) 、-1661(0厶）、-1356(6>厶）、-1128(厶>6)、-1094(0厶）和-1079〇'〉〇位點（見附圖2) 〇
[0031] 實施例2雞MMP13 5'調(diào)控區(qū)多態(tài)性與開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析
[0032] 1試驗材料
[0033] 隨機選取37只濟寧百日雞（濟寧大唐百日雞保種場）、53只文昌雞（海南省文昌 雞育種公司）、46只汶上蘆花雞（山東省濟寧市汶上縣）、45只海蘭褐雞（山東泰安海蘭褐 育種公司）和有產(chǎn)蛋記錄的隱性白洛克雞510只（山東紀華家禽育種有限公司）。以上均 為隨機采樣，翅靜脈采血，提取基因組后，-20 °C保存。
[0034] 2試驗方法
[0035] 2. 1PCR擴增
[0036] 以基因組為模版，進行PCR擴增。引物見表1，反應體系40yL，其中包括2yL基因 組DNA(50-100ng)，4yLlOXEx-buffer，3.2yLdNTPs(2. 5mMeach，TaKaRa)，上下游引物 各0·8μL(10μM)，0·2μLEχ-TaqDNApolymerase(5U/μL，TaKaRa)，ddH20補足至40μL。 擴增程序：94°C預變性4min;94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸45sec，進行35個 循環(huán)；循環(huán)結束72°C，孵育5min。
[0037]PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（AxyPr印DNA GelExtractionKit，AXYGEN)進行回收，送濟南博尚生物技術公司測序。
[0038] 2. 2單倍型構建及關聯(lián)分析
[0039] 利用DNAMANversion7. 0和ChromasPro對突變位點進行統(tǒng)計分析。
[0040]R軟件用于統(tǒng)計基因型和基因型頻率，PHASE軟件用于單倍型構建。
[0041] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SAS8. 1統(tǒng)計軟件包的GLM程序進行基因型與性狀（產(chǎn)蛋數(shù)、開產(chǎn)日 齡）的關聯(lián)分析。
[0042] 不同基因型間的比較分析用最小二乘法，試驗數(shù)據(jù)用最小二乘均值土標準誤表 示（LSM土SE)，顯著水平設定P〈0. 05。
[0043] 3結果與分析
[0044] 3. 1MMP13 5'調(diào)控區(qū)6個突變位點在隱性白洛克雞中基因型和等位基因頻率的 分布
[0045] 用SHEsis在線軟件分析MMP13 5'調(diào)控區(qū)6個突變位點在隱性白洛克雞中的連鎖 不平衡關系，結果表明：-1719和-166U-1356和-1128、-1094和-1079位點分別呈現(xiàn)完全 連鎖狀態(tài)（附圖3)。故取-1719、-1356和-1079位點進行單個位點標記分析。
[0046] 共統(tǒng)計隱性白洛克510個個體，由表2可知，-1719、-1356和-1079位點的優(yōu)勢等 位基因分別為T、G、T;野生純合基因型和雜合基因型的頻率均高于突變純合基因型。
[0047] 表2隱性白洛克雞中多態(tài)位點的基因型和等位基因頻率
[0048]
[0049] 3· 2MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1719、-1356和-1079位點多態(tài)性分析及其與生產(chǎn)性能的關 聯(lián)分析
[0050] 3. 2. 1MMP13 5'調(diào)控區(qū)多態(tài)性位點在不同雞品種中的分布
[0051] 統(tǒng)計了白洛克、海蘭褐雞、文昌雞、濟寧百日雞和汶上蘆花雞品種的基因型和等位 基因頻率。其中，海蘭褐雞中的-1719與-1661位點沒有檢測到突變基因型，其他位點分析 結果見表3至表8。
[0052] 表3MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1719位點基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0053]
[0054] 表4MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1661位點基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0055]
[0056]表5MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1356位點基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0059] 表6MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1128位點基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0060]
[0061] 表7MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1094位點基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0062]
[0063] 表8MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1079位點基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0064]
[0065] 3. 2. 2隱性白洛克中MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1719、-1356和-1079位點多態(tài)性與生產(chǎn) 性能的關聯(lián)分析
[0066] 在510只隱性白洛克群體，分析MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1719、-1356和-1079位點對32 周（E32)產(chǎn)蛋數(shù)的效應，結果均未達到p〈0. 05的統(tǒng)計顯著水平。但對開產(chǎn)日齡（AFE)，-1356 和-1079位點均達到p〈0. 05的統(tǒng)計顯著水平，分別為AA型和CC型的個體開產(chǎn)較早。表明 兩個突變位點純合基因型均與開產(chǎn)早的性狀有關聯(lián)。
[0067]表9.白洛克中不同基因型與開產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋數(shù)的關聯(lián)分析
[0068]
[0069] 注：表中數(shù)值為AFE(開產(chǎn)日齡）和E32 (32周產(chǎn)蛋量）的最小二乘均值土標準 誤，不含相同字母最小二乘均值間差異顯著（P< 〇. 05)。
[0070] 3. 3MMP13 5'調(diào)控區(qū)-1356和-1079位點單倍型分析及其與生產(chǎn)性能的關聯(lián)分析
[0071] 3. 3. 1MMP13 5'調(diào)控區(qū)單倍型在不同品種中的分布
[0072] 用PHASE軟件對雞MMP13基因5 ^調(diào)控區(qū)-1356和-1079突變位點構建了四種單 倍型：GT、GC、AT和AC。由表10看出，雞MMP13