技術(shù)的抗原結(jié)合域使用，從而成功地實(shí)現(xiàn)了雙靶點(diǎn)雙 特異性的CAR技術(shù)，也在療效試驗(yàn)中驗(yàn)證了前述雙特異性CAR技術(shù)相對于傳統(tǒng)CAR-T技術(shù) 的多種理論優(yōu)勢。同時我們發(fā)現(xiàn)此發(fā)明還得以避免了以scFv為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的CAR-T所常有 的表達(dá)困難、穩(wěn)定性差等缺陷。我們的CD19x CD20雙特異性單域抗體-CAR技術(shù)在體外高 效地轉(zhuǎn)導(dǎo)了健康人T淋巴細(xì)胞，對于CD19和CD20陽性的靶細(xì)胞產(chǎn)生了強(qiáng)力的殺傷效果，在 基于NOG小鼠的高質(zhì)量人淋巴瘤模式動物體內(nèi)起到了比單特異性CAR-T更好的治療效果。
[0027] 本發(fā)明通過優(yōu)化設(shè)計(jì)⑶19、⑶20特異的單域抗體，提供了 一種⑶19、⑶20雙靶 點(diǎn)修飾的CAR-T細(xì)胞，能夠特異地與⑶19及CD20抗原結(jié)合。此外，在B淋巴細(xì)胞系惡性 腫瘤治療中，采用CD19、CD20雙靶點(diǎn)修飾的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行CAR-T療法與單獨(dú)的CD19或 CD20CAR-T相比，明顯增強(qiáng)了免疫細(xì)胞靶向識別腫瘤抗原的能力，加強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷 活性。
【附圖說明】
[0028] 圖1為基于⑶19x⑶20單域抗體的嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)圖。
[0029] 圖2為基于⑶19x⑶20單域抗體雙特異性CAR-T體外殺傷效果圖。其中，Raji細(xì)胞 為靶細(xì)胞，A)只加入未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，B)加入⑶19 CAR-T細(xì)胞，C)加入⑶19 CAR-T細(xì)胞， D)加入CD19xCD20 CAR-T細(xì)胞。根據(jù)Raji細(xì)胞占總細(xì)胞的比例結(jié)果顯示，與未加入CAR-T 細(xì)胞的對照組相比，B)、C)與D)組對Raji腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，而⑶19x⑶20 CAR-T細(xì) 胞的殺傷效果最好。
[0030] 圖3為小鼠生存曲線；分別對24只NOG小鼠尾靜脈注射Raji細(xì)胞。10天以后，將 注射Raji細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分成四組，分別注射等量（400萬細(xì)胞）的T細(xì)胞、CD19 CAR-T細(xì) 胞、⑶20 CAR-T細(xì)胞以及⑶19x⑶20 CAR-T細(xì)胞。連續(xù)觀察動物5周，記錄小鼠死亡時間。 注射未轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的小鼠基本上在20天內(nèi)全部死亡，注射⑶19 CAR-T細(xì)胞的小鼠在40天 時發(fā)生1例死亡，注射⑶20 CAR-T細(xì)胞的小鼠在42天時發(fā)生1例死亡，而注射⑶19x⑶20 CAR-T細(xì)胞的小鼠在觀察期間均未發(fā)生死亡。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明利用多個各自特異的單域抗體進(jìn)行CAR設(shè)計(jì)修飾，涉及識別多個靶點(diǎn)的 CAR-T技術(shù)，協(xié)同殺傷包括血液系腫瘤的腫瘤，防止免疫逃逸及腫瘤復(fù)發(fā)。下面結(jié)合具體實(shí) 施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0032] 實(shí)施例1⑶19與⑶20單域抗體制備
[0033] (一）⑶19與⑶20單域抗體文庫構(gòu)建
[0034] 利用購自R&D SYSTEMS公司的⑶19及⑶20抗原對美洲駝進(jìn)行定期免疫。第一次 免疫時，分別將200 μ g重組⑶19或⑶20蛋白與等體積弗氏佐劑混合，其后用弗氏不完全 佐劑與抗原混合，進(jìn)行免疫，每周一次。經(jīng)多次免疫加強(qiáng)美洲駝對靶抗原的免疫應(yīng)激反應(yīng)， 刺激B細(xì)胞表達(dá)針對靶抗原的重鏈抗體。
[0035] 免疫期間對免疫動物取血采樣，評估免疫反應(yīng)效果。免疫結(jié)束后，取IOOmL美洲駝 外周血淋巴細(xì)胞并提取Total RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過二次PCR擴(kuò)增美洲駝重鏈抗體的 可變區(qū)片段VHH。將VHH片段構(gòu)建入噬菌體展示載體中，并通過電轉(zhuǎn)化將攜帶有單域抗體基 因片段的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌中，從而獲得單域抗體免疫文庫。
[0036] 第一次 PCR 模板：cDNA ;
[0037] 上游引物 CALL001，如 SEQ ID N0:21 所示：5' -GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3' ；
[0038] 下游引物 CALL002,如 SEQ ID N0:22 所示：5' -GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3' ；
[0039] 第二次PCR模板：第一次PCR割膠回收產(chǎn)物；
[0040] 上游引物 BACK-1，如 SEQ ID N0:23 所示：5' -GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGA GG-3' ；BACK-2,如 SEQ ID N0:24 所示：5' -GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGG-3' ；
[0041] 下游引物 PMCF，如 SEQ ID N0:25 所示：5' -CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGG GT-3' ；
[0042] 兩次PCR程序均為：預(yù)變性94°C、7min，變性94°C、lmin，退火55°C、lmin，延伸 72°C、7min。
[0043] (二）⑶19與⑶20單域抗體篩選及表達(dá)
[0044] 利用噬菌體展示技術(shù)將單域抗體分子展示于噬菌體表面，進(jìn)而篩選出抗原特異性 的單域抗體。通過噬菌體酶聯(lián)免疫吸附ELISA方法，將抗原用IOOmM NaHCO3 (pH 8.0)稀釋 至終濃度為100 μ g/mL，包被IOOyL至96孔板中，4°C過夜。經(jīng)過PBS沖洗、1 %脫脂牛奶 封閉后，加入噬菌體孵育1~2h，然后將抗原特異性的噬菌體洗脫并侵染TGl細(xì)胞，在含有 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上涂布培養(yǎng)，經(jīng)過多輪篩選逐步達(dá)到富集。挑選大量陽性克隆進(jìn)行 ELISA檢測并對陽性克隆進(jìn)行測序，根據(jù)序列比對，確定獨(dú)特的的克隆并將其序列分為框架 區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)⑶R。
[0045] 將測序正確的克隆接種在5mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過 夜；接種ImL的菌液至300mL TB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)至0D6QQnni= 0. 6~0. 9時，加入 IM IPTG，28°C搖床培養(yǎng)過夜；離心，收菌；利用滲透法，獲得抗體粗提液；通過Protein L標(biāo) 記并利用親和層析法純化出單域抗體，其產(chǎn)量均在l〇mg/L以上。利用SPR技術(shù)檢測抗體的 親和力，進(jìn)一步篩選出特異性高的單域抗體。通過以上實(shí)施方式，共獲得6株CD19單域抗 體、5株CD20單域抗體。選擇親和力較高的單域抗體，其中一株CD19單域抗體具有SEQ ID NO: 11所示的核甘酸序列，一株CD20單域抗體具有SEQ ID N0:20所示的核甘酸序列。
[0046] 實(shí)施例2⑶19與⑶20雙特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞的制備
[0047] (一）嵌合抗原受體基因片段制備
[0048] 本發(fā)明按以下編碼基因的順序設(shè)計(jì)融合基因片段：CD8信號肽、⑶19 VHH-Iinker-⑶20 VHH、⑶28跨膜區(qū)以及⑶28和⑶3 ζ胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，通過基因合成技 術(shù)直接合成該融合基因，使表達(dá)的嵌合抗原受體具有⑶8 a -VHH(⑶19-linker-⑶20)-⑶28 TM-⑶28-⑶3 ζ的氨基酸結(jié)構(gòu)。將購自Clontech公司的pLVX-Puro載體的CMV啟動子改造 為人EFla啟動子從而獲得pLVX-hEFla載體，將合成的基因片段構(gòu)建在pLVX-hEFla載體 上，形成重組質(zhì)粒，命名為 PLVX-CD8 a -VHH(CD19-linker-CD20) -CD28 TM-CD28-CD3 ζ 〇
[0049] CD8信號肽的核酸序列如SEQ ID NO:26所示；
[0050] Linker的核酸序列如SEQ ID NO:27所示；
[0051] CD28 TM及CD28-CD3 ζ胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域的核酸序列如SEQ ID N0:28所示；
[0052] (二）嵌合抗原受體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
[0053] 在本發(fā)明中，CAR-T細(xì)胞通過基因修飾的CAR、慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞而 獲得。提取 PLVX-CD8 a -VHH(CD19-linker-CD20)-CD28 TM-CD28-CD3 ζ 表達(dá)質(zhì)粒和 pRRE、 pRSV-rev及pMD2. G輔助質(zhì)粒，按一定比例混合，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h、96h后，收集含 有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清，4°C、3000rpm離心5min。上清經(jīng)0. 45 μ m濾器過濾后，與PEG8000/ NaCl按4:1體積混勻，4°C靜置2~3h后高速離心30min。棄上清，沉淀用預(yù)冷的PBS重懸 溶解，即獲得病毒濃縮液，_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054] (三）T淋巴細(xì)胞的制備
[0055] 取50mL健康人新鮮血液，通過淋巴細(xì)胞分離液、密度梯度離心方法分離外周血單 核細(xì)胞（PBMC)。利用 Pa