綜上分析可知，本發(fā)明提供的柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型核酸巧光PCR檢 測試劑盒在同一樣本中同時檢測2種腸道病毒，而不能檢測出其他病原體RNA，采用磁珠法 提取RNA，可W獲得高純度和高得率的核酸，大大提高了檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，檢測 靈敏度可達400copie/ml，檢測范圍為4. 0E+02~4. 0E+08copies/ml，為早期診斷柯薩奇病 毒A16型和腸道病毒71型感染提供可靠的實驗證據(jù)。
【主權(quán)項】
1. 一種柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型核酸熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，包 括以下各組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、CA16/EV71酶混合液、CA16/ EV71陽性對照、CA16/EV71陰性對照，其中，所述內(nèi)標(biāo)為插入pUC18T載體的長為90堿基對 的人工合成DNA序列的重組體，其濃度為1. 00E+03copies/ml~1. 00E+06copies/ml;所述 90喊基對的序列為： 5'-CAGCTTGTTGTAACAAAGCATCCGCTCCCCCATTCATGTTGCTGGGTACAGACAGTTACCTCTCCACTAG GCAAATCTCAACAGGATCAG-3, 。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述RNA提取溶液包括如下組分： RNA提取溶液I:十二烷基硫酸鈉，質(zhì)量/體積0.3 %~1.2%、曲拉通，體積/體積 1. 0%~5. 0%，異硫氰酸胍 0·lmol/L~1. 2mol/L、50μg/ml~350μg/ml的磁珠； RNA提取溶液II :4-羥乙基哌嗪乙磺酸150mmol/L~350mmol/L、pH6. 5±0. 2,氯化鈉150mmol/L~400mmol/L； RNA提取溶液III:曲拉通，體積/體積0. 5%~3. 0%、氯化鈉100mmol/L~400mmol/L； RNA提取溶液IV:礦物油。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述RNA洗脫液為Tris-HCl 0· 5mol/L~L5mol/L、EDTAO. 2mol/L~L5mol/L〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液為5XPCR反應(yīng)緩 沖液10μl，2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0· 1μ mol/L~0· 5μ mol/L用于祀多核苷酸擴 增的上下游引物CA16-F、EV71-F與CA16-R、EV71-R，0. 1ymol/L~0· 5ymol/L用于靶多 核苷酸檢測的探針CA16-P、EV71-P，0· 1μmo1 /L~0· 4μmo1 /L用于檢測內(nèi)標(biāo)的上下游引物 IC-F與IC-R，0.lymol/L~0. 4ymol/L用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針I(yè)C-P。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于靶多核苷酸擴增的上下 游引物以及用于靶多核苷酸檢測的探針，其堿基對序列分別為： CA16 上游引物CA16-F:5' -TATGTTAATTGGGACATTGATTTGA-3' ； CA16 下游引物CA16-R:5' -ACCATTGGGTTTGGCTACG-3' ； CA16 探針CA16-P:5' -FAM-ATATGCTCAGCTGCGGCGG-BHQ1-3' ； EV71 上游引物EV71-F:5' -TCCCACATTCGGAGAACACA-3' ； EV71 下游引物EV71-R:5' -AAGGGTACTTGGACTTGGAGGT-3' ； EV71 探針EV71-P:5' -HEX-AGGAGAAAGATCTTGAATACGGGGC-BHQ1-3'。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述用于檢測內(nèi)標(biāo)的上下游引物 以及用于檢測內(nèi)標(biāo)的探針I(yè)C-P，其堿基對序列分別為： 內(nèi)標(biāo)上游引物IC-F:5' -CAGCTTGTTGTAACAAAGCA-3' ； 內(nèi)標(biāo)下游引物IC-R:5' -CTGATCCTGTTGAGATTTGCC-3' ； 內(nèi)標(biāo)探針I(yè)C-P:5'R0X-CTCCCCCATTCATGTTGCTGGG-BHQ13'。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CA16/EV71酶混合液為mMLV 酶10U/μ1~150U/μ1，H-Taq DNA聚合酶1U/μ1~10U/μ1。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CA16/EV71陽性對照品為經(jīng)過 標(biāo)定的已知濃度的假病毒，其濃度為1. 〇〇~5. 00E+05copie/ml。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述CA16/EV71陰性對照：品為經(jīng) 過滅菌處理的生理鹽水。10. 使用根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的檢測試劑盒用于檢測樣本中CA16/EV71-RNA 的方法，包括如下步驟： (1) 試劑準(zhǔn)備； 按照提取試劑I200μ1~lml/人份，CA16/EV71-內(nèi)標(biāo)1μ1/人份的比例，取相應(yīng)量 的RNA提取溶液I及CA16/EV71-內(nèi)標(biāo)，充分混勻得提取溶液Ι-mix，瞬時離心后備用； 根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按照PCR反應(yīng)液38μ1/人份，CA16/EV71-酶混合液2μ1/人份的比例，取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及CA16/EV71-酶混合液，充分混 勻，得PCR-mix，瞬時離心后備用； (2)RNA提?。捍胖榉ㄌ崛-RNA; S01裂解病毒：每個離心管中加入100μΙ~lmlRNA提取溶液Ι-mix，然后加入 100μ1~lml待測樣本，蓋上管蓋，震蕩混勻，瞬時離心后備用； S02磁珠吸附核酸：在步驟S01瞬時離心后備用的溶液中加入30μ1~400μ1RNA提 取溶液II，震蕩混勻，室溫靜置10~30分鐘； S03去除雜質(zhì)：靜止結(jié)束瞬時離心后，將離心管置于磁珠分離器上，2~5分鐘后緩慢將 溶液吸出棄用，磁珠備用； S04洗滌：在步驟S03保留備用的磁珠內(nèi)加入200μ1~lmlRNA提取溶液III和 100μ1~400μ1RNA提取溶液IV，震蕩混勻，瞬時離心后將離心管再次置于分離器上； S05去除廢液：靜止，上清液分為兩層，將吸頭插入離心管底部，從底部開始緩慢將液 體完全吸出丟棄，靜置，將管底殘余液體完全吸出丟棄，磁珠備用； S06洗脫核酸：在步驟S05保留備用的磁珠中加入10μ1~100ulRNA洗脫液，將離 心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻，室溫靜置5~30分鐘后將離心管再次置于分離器上 2~5分鐘，然后將洗脫下來的RNA吸至新的1. 5ml滅菌離心管中； S07根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，每個反應(yīng)管加入40μ1PCR-mix，并 吸取步驟S06的新的滅菌離心管中已處理的樣本RNA、陰性對照、陽性對照各10μ1加入 PCR-mix中，蓋好管蓋，形成待測樣品； (3) 熒光PCR反應(yīng)：采用實時熒光定量PCR技術(shù)，以CA16、EV71病毒蛋白外殼VP1基 因為擴增靶目標(biāo)，使用所述試劑盒，在實時熒光PCR儀上通過PCR擴增對待測樣品中CA16/ EV71-RNA進行定性檢測； (4) 結(jié)果分析：選擇FAM通道（Reportere:FAM，Quencher:None)檢測CA16 ; 選擇HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None)檢測EV71 ;選擇R0X通道 (Reporter:R0X,Quencher:none)檢測內(nèi)標(biāo)；利用儀器自帶的軟件進行自動分析或者手動 調(diào)芐基線的開始值、結(jié)束值以及閾值線值進行分析，然后記錄樣本Ct值結(jié)果，根據(jù)各樣本 Ct值大小，判斷檢測結(jié)果。
【專利摘要】本發(fā)明實施例公開了一種柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型核酸熒光PCR檢測試劑盒，其包括以下組分：RNA提取溶液、RNA洗脫液、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、CA16/EV71酶混合液、CA16/EV71陽性對照、CA16/EV71陰性對照，本試劑盒在同一樣本中同時檢測柯薩奇病毒A16型、腸道病毒71型兩種腸道病毒，而不能檢測出其他病原體RNA，采用磁珠法提取RNA，提高了檢測靈敏度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，檢測靈敏度可達400copie/ml，檢測范圍為4.0E+02～4.0E+08copies/ml，為早期診斷柯薩奇病毒A16型和腸道病毒71型感染提供可靠的實驗證據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公開號】CN105368986
【申請?zhí)枴緾N201510925723
【發(fā)明人】戴立忠, 黃河, 鄧中平, 易曉明
【申請人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月11日