，該綠豆種質引自亞洲蔬菜中心(AVRDC)。將冀綠7號和VI128雜交，單株收獲F:代。將來自于同一 F:單株的種子繁殖成F 2代分離群體，共獲得158個匕單株。同時將Fi單株與輪回親本冀綠7號進行回交，獲得105個單株。F2隨機取30粒種成株行，獲得F2:3家系。
[0034]抗豆象鑒定方法:
[0035]對親本、匕、匕和BC廊F 2:3家系進行抗豆象鑒定。每個單株隨機取90粒種子，分成3個重復，每個重復30粒，分別放于直徑5cm，高2.5cm的小塑料盒中(無蓋)，然后將小塑料盒放入大塑料盒內(規(guī)格:660X440X 180mm)。上面蓋兩層黑布，置于養(yǎng)蟲室中，養(yǎng)蟲室溫度控制在28±2°C，相對濕度70% -80% ο每個大塑料盒內放入400-500頭剛羽化l_3d的豆象成蟲進行產卵，待每粒種子上著卵量達5粒以上時除去成蟲。利用感蟲親本冀綠7號作為對照，待對照種子受害率達100%時，調查每份材料的受害率?？垢袠藴?受害率小于20%為高抗，受害率20% -80%為中等抗性，受害率大于80%為感。
[0036]分子標記引物設計及多態(tài)性標記篩選:
[0037]利用自主測序獲得的綠豆轉錄組Unigenes序列數據庫，采用MISA尋找SSR位點，并利用Primer3設計SSR引物，產物片段范圍150_300bp，共獲得2882對SSR引物。根據F2:3代抗豆象鑒定結果，從F2中選取10株純合感豆象單株和10株純合抗豆象單株的DNA等量混合，構建抗感池。利用抗感池和兩親本DNA篩選多態(tài)性SSR標記。
[0038]基因組DNA提取:
[0039]取新鮮的三出復葉0.lg用液氮冷凍并磨成粉，使用天根公司的植物基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠檢測DNA質量，經紫外分光光度計測定濃度后，加ddH20稀釋至10ng/ μ L備用。
[0040]PCR擴增及電泳檢測:
[0041 ] PCR 擴增反應在 ABI Applied B1systems Veriti 96ffell Thermo 1 Cycler 擴增儀上進行，反應體系為10 μ L，包含IX PCR buffer, 0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2 μ M，20ng基因組DNA，0.5U Taq酶。反應程序為95°C預變性5min ;95°C變性30s，55°C退火45s, 72°C延伸45s，循環(huán)35次；72°C延伸lOmin。擴增產物經8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在280V恒壓下電泳，根據PCR產物分子量大小及差異帶型的可辨程度調整電泳時間。將凝膠從玻璃板轉移到染色盒，用蒸餾水洗滌2次，然后用0.1% AgN03溶液染色lOmin，蒸餾水快速漂洗2次，加1.5% Na0H(0.5%甲醛)溶液顯影至條帶清晰，再用蒸餾水洗掉凝膠上殘留的顯影液，拍照讀帶。
[0042]抗豆象基因遺傳分析:
[0043]親本VI128對綠豆象表現(xiàn)高抗，親本冀綠7號表現(xiàn)高感，F(xiàn)i代表現(xiàn)高抗(圖1)。F2R抗感分離比為115抗:37感，卡方檢驗符合3:1的理論比率，X 2= 0.035 ( x 20.05 =3.54，df = 1)。BCjf抗感分離比為59抗:46感，卡方檢驗符合1:1的理論比率，x 2 =1.61 (x20.05 = 3.54, df = 1)。因此推斷V1128的抗豆象基因為單顯性主基因。延續(xù)前人的命名規(guī)則，將該基因定名為Br3。
[0044]抗豆象基因定位:
[0045]從2882個SSR標記中篩選出13個在抗感池間表現(xiàn)多態(tài)性的標記。利用13個多態(tài)性SSR標記對F2分離群進行基因分型(圖2)，并利用QTL IciMapping V4.0計算各個分子標記與抗豆象基因之間的遺傳距離，結果有8個SSR標記成功構建到連鎖群中，其中離抗豆象基因Br3最近的分子標記為SYD404，遺傳距離為4.00cM(圖3)，所對應的SSR引物的序列為:
[0046]上游引物:5z ACGGCTATTCATCGTTTTGC 3 ^
[0047]下游引物:5, CAACCCGAAGCCAAAAACTA 3 ^。
[0048]實施例2分子標記的驗證
[0049]為了驗證分子標記SYD404在實際育種中的選擇效果，我們根據抗豆象鑒定結果，從冀綠7號XV1128FS代重組自交系群體(RILs)中分別隨機選擇了 20個抗豆象株系和感豆象株系，采用SSR引物(上游引物:5 , ACGGCTATTCATCGTTTTGC 3 ,;下游引物:
5' CAACCCGAAGCCAAAAACTA 3 ')進行PCR擴增驗證，分別以感豆象親本冀綠7號(無抗性基因)和抗豆象親本V1128(有抗豆象Br3基因)作為對照。
[0050]PCR反應體系為10yL，含1XPCR緩沖液，0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2 μ M，20ng冀綠7號XVlUSFi^株系基因組DNA，0.5U Taq酶；
[0051]PCR擴增程序:95°C預變性5min，然后每個循環(huán):95度變性30s，55 °C退火45s，72°C延伸45s，共進行35次循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0052]電泳檢測使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物。在PCR產物中加2yL上樣緩沖液，280V恒電壓電泳lh。0.1% AgN03染色10min,l.5% NaOH (含0.5%甲醛)溶液顯影。
[0053]擴增結果表明感豆象后代全部擴增出與冀綠7號相同的帶型，抗豆象后代株系的擴增產物中均有113bp條帶，表現(xiàn)為與V1128相同的帶型(圖4)。因此，說明SYD404引物可以作為篩選V1128抗豆象基因Br3的分子標記，用于抗豆象綠豆品種V1128的分子標記輔助育種。
【主權項】
1.一種用于綠豆品種V1128抗豆象新基因Br3輔助選擇的分子標記，命名為SYD404，其特征在于所述的分子標記是以綠豆品種V1128的基因組DNA為模板，采用1對SSR引物經PCR擴增后得到；所述的SSR引物的序列為: 上游引物:5 z ACGGCTATTCATCGTTTTGC 3 ^ 下游引物:5 z CAACCCGAAGCCAAAAACTA 3。2.如權利要求1所述的分子標記，其特征在于用于擴增所述分子標記的PCR反應體系和擴增程序為: PCR反應體系為10yL，含1XPCR緩沖液，0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2 μ M，20ng綠豆品種VI128的基因組DNA，0.5U Taq酶； PCR擴增程序:95°C預變性5min，然后每個循環(huán):95度變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，共進行35次循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。3.權利要求1或2所述的分子標記在抗豆象綠豆品種V1128輔助育種中的用途。4.一種用于綠豆品種V1128抗豆象新基因Br3輔助選擇的SSR引物，其特征在于所述的SSR引物的序列為: 上游引物:5 z ACGGCTATTCATCGTTTTGC 3 ^ 下游引物:5 , CAACCCGAAGCCAAAAACTA 3 ^。5.權利要求4所述的SSR引物在抗豆象綠豆品種V1128輔助育種中的用途。6.一種篩選含有抗豆象基因Br3的綠豆品種V1128雜交后代的方法，其特征在于包括以下步驟:以待測綠豆品種V1128的雜交后代基因組DNA為模板，用權利要求4所述的SSR引物進行PCR擴增，電泳檢測擴增產物，擴增產物中有113bp條帶的待測綠豆材料為候選的含有抗?象基因Br3的后代材料。7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的PCR擴增的反應體系和擴增程序為: PCR反應體系為10yL，含1XPCR緩沖液，0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2 μ M，20ng綠豆品種VI128的雜交后代基因組DNA，0.5U Taq酶； PCR擴增程序:95°C預變性5min，然后每個循環(huán):95度變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，共進行35次循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于綠豆抗豆象新基因Br3輔助選擇的分子標記及其應用，本發(fā)明所述的分子標記，命名為SYD404，其是以綠豆品種V1128的基因組DNA為模板，通過采用1對SSR引物經PCR擴增后得到，與抗豆象基因Br3的遺傳距離為4.0cM。本發(fā)明的一種分子標記為綠豆品種V1128的抗豆象育種提供了一條很好的途徑，可以將選擇提前到綠豆生長苗期進行，既可以免除大量費時費力的抗豆象鑒定工作，又可以對育種材料進行早代選擇，并可以對目標基因進行精準的逐代跟蹤。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105368956
【申請?zhí)枴緾N201510919626
【發(fā)明人】劉長友, 田靜, 范保杰, 曹志敏, 蘇秋竹, 王彥, 張志肖
【申請人】河北省農林科學院糧油作物研究所
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月11日