knockdown抑制小鼠肺癌的轉(zhuǎn)移
[0035] 圖10免疫巧光實(shí)驗(yàn)表明，NATD knockdown導(dǎo)致H1299細(xì)胞表面E-ca化erin增多， N-ca化erin減少。
[0036] 圖11實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果表明NATD knockdown抑制了H1299細(xì)胞的EMT 過程
[0037]圖12 NATD knockdown抑制了H1299細(xì)胞的EMT過程。
[0038] 圖13 NATD序列比對(duì)預(yù)測(cè)NATD催化活性位點(diǎn)為為高度保守的RxxGxG乙酷輔酶A 結(jié)合基序。
[0039] 圖14體外乙酷化反應(yīng)的放射性強(qiáng)度測(cè)試表明，原核表達(dá)的NATD有乙酷基轉(zhuǎn)移酶 活性，缺少催化區(qū)域核屯、氨基酸的NATD Δ則沒有活性
[0040] 圖15 Western-blot證實(shí)NATD的體外乙酷化活性，NATD Δ則沒有活性。
[0041] 圖16 W肺癌細(xì)胞中的組蛋白提取物為底物，原核表達(dá)的NTAD有乙酷基轉(zhuǎn)移酶活 性，缺少催化區(qū)域核屯、氨基酸的NATD Δ則沒有活性。
[0042] 圖17實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果表明NATD Δ過表達(dá)的化299穩(wěn)定細(xì)胞株中Slug 的表達(dá)受到抑制。
[004引圖18化IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明NATD水平的變化影響了Slug啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白標(biāo)記的 水平。
[0044]圖19 Western-blot證實(shí)NATD水平的變化影響了Slug啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白標(biāo)記的 水平。
[004引圖20 NATD對(duì)EMT進(jìn)行調(diào)控的模型。
【具體實(shí)施方式】
[0046]本發(fā)明采用Real-time PCR和免疫組化技術(shù)對(duì)29例非小細(xì)胞肺癌病人的腫瘤標(biāo) 本與正常組織中NATD的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NATD在肺癌病人的腫瘤組織中表達(dá)水平 顯著升高，并且與病人的死亡率正相關(guān)。構(gòu)建NATD knockdown的非小細(xì)胞肺癌穩(wěn)定細(xì)胞株， 檢測(cè)到癌細(xì)胞的遷移能力受損。免疫組化及Real-time PCR檢測(cè)表明NATD對(duì)EMT過程中 關(guān)鍵分子基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，NATD表達(dá)水平的下降可W抑制EMT轉(zhuǎn)換過程。使用突變技 術(shù)構(gòu)建了沒有催化活性的NATD(簡(jiǎn)寫為NATD Δ)，體外乙酷化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了缺失的乙酷輔酶A 結(jié)合位點(diǎn)對(duì)NATD生物活性的必需性。我們發(fā)現(xiàn)NATD可W通過調(diào)控Slug基因的表達(dá)水平 參與EMT過程的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且運(yùn)種作用是依賴NATD的乙酷化 酶活性的。NATD催化Slug啟動(dòng)子上組蛋白H4發(fā)生N端α -乙酷化從而提高Slug的表達(dá)， 使細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化。
[0047] 本發(fā)明具體實(shí)施例中所設(shè)及的試劑除特別說明外，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常 規(guī)試劑。本發(fā)明中所述的室溫為25 + 5Γ。
[004引[1]NATD基因水平的檢測(cè)：
[0049] 為了驗(yàn)證NATD在肺癌病人腫瘤組織中的表達(dá)水平，我們收集了 29例肺癌病人的 RNA和腫瘤組織切片樣本，采用Real-timePCR技術(shù)在29例非小細(xì)胞肺癌組織和相應(yīng)的正 常組織中檢測(cè)了NATDmRNA表達(dá)情況。結(jié)果見圖1。數(shù)據(jù)顯示為Mean±SD，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，沖<0.05, *沖<0.01。結(jié)果顯示有69% (20/29)的肺癌病人 腫瘤組織中的NATDmRNA的表達(dá)水平均高于其正常組織。
[0050] 具體實(shí)施步驟如下：
[0051]a)收集病人正常組織和腫瘤組織，切成小塊用液氮研磨，加入1mlTrizol Reagent溶解。
[005引b)加入200μ1氯仿，震蕩15秒后，室溫靜置2-3分鐘，12000g，4°C離屯、15分鐘。
[0053]C)吸取上層水相，加入500μ1異丙醇，室溫靜置10分鐘，12000g，4°C離屯、10分 鐘。
[0054] d)倒去上清，加入1ml70%乙醇，7500g，4°C離屯、5分鐘。
[005引 e)倒去上清，驚干后加入20μ1DEPC水溶解RNA，測(cè)定濃度。
[0056]f)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到相應(yīng)的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括4μ1 5XPrimeScriptBuffer、！μ1PrimeScriptRTEnzymeMixΙ、1μ1OligodT P;rime;r(50yM)、lylRandom6mers(100μM)(Takara公司）、lμg總RNA，最后用去離子 水補(bǔ)足至20μ1體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為37°C解育15分鐘，85°C反應(yīng)5秒。
[0057]g)使用NATD基因的特定引物進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量PCR來檢測(cè)NATD基因的表 達(dá)水平。實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系包括10μ1hstStartUniversalSYBRGreen Master(Roche公司）、0.25μl50μM正向引物、0.25μl50μM反向引物、7.5μl去離子 水、2μ1cDNA模板。儀器使用的是CorbettRoter-Gene6000巧光定量PCR儀，反應(yīng)條件 是：95°C10分鐘進(jìn)行1個(gè)循環(huán)一 95°C15秒、60°C20秒、72°C20秒進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。反應(yīng) 結(jié)束后使用儀器自帶軟件分析NATD基因表達(dá)水平。
[0058]NATD基因?qū)崟r(shí)巧光定量PCR引物：正向引物：5' -TACCTCATCGCGTGGGAAAAC-3' ；反 向引物：5 ' -GGATCTGTATGAGGAACTTCC-3，。
[0059] 內(nèi)參GAPDH基因?qū)崟r(shí)巧光定量PCR引物：正向引物：5' -GAAGGTGAAGGTCGGAG-3'; 反向引物：5 ' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '。
[0060] [2]anti-NATD和anti-N-α-ac-H4兩種特異性抗體的制備和檢測(cè)：
[0061] 為了驗(yàn)證NATD蛋白在肺癌病人腫瘤組織中的表達(dá)水平和生物活性，我們分別制 備了anti-NATD和anti-N-α-ac-H4兩種特異性抗體。圖2、圖SWesternblot分別驗(yàn)證了 兩種抗體的特異性。
[0062] 具體實(shí)施例及步驟如下：
[006引（1)NATD抗體的制備和檢測(cè)
[0064]a)我們首先構(gòu)建NATD原核表達(dá)載體。使用pGEX-化-1GST表達(dá)載體，克隆構(gòu)建方 法見參考文獻(xiàn)"。PCR引物如下：
[0065]Forwardprimer:5，一at邑邑邑邑a邑aaa邑tcaa邑caa
[0066] Reverse primer :5'一tea邑t邑邑ca邑ca邑ccaccac
[0067] b)挑克隆進(jìn)行測(cè)序，確定正確的pGEX-化-1-NATD載體。
[0068] C)IPTG誘導(dǎo)化21大腸桿菌表達(dá)純化后得到GST-NATD。
[0069] d)使用Prescission酶切除GST標(biāo)簽得到原核NATD。
[0070]e)將經(jīng)原核表達(dá)純化得到的NATD蛋白交給金斯瑞公司進(jìn)行多克隆抗體的制備。
[0071] f)使用該抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)原核表達(dá)的NATD蛋白。
[0072] Western blot具體實(shí)施步驟如下：
[0073] 1)用BSA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
[0074] 2)取相同質(zhì)量的蛋白量（體積X蛋白質(zhì)濃度），并加入5X電泳加樣緩沖液。
[00巧]3)100°C煮樣5分鐘。
[007引 4)上樣，電泳。90V，大約15-20分鐘，樣品中的漠酪藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠后，電壓 調(diào)至120V，電流過程中保持電壓恒定。當(dāng)漠酪藍(lán)指示劑遷移至距前沿l-2cm處即停止電泳， 約1-2小時(shí)。
[0077] 15 %的分離膠和5 %的濃縮膠：
[0078]
[0080] 5)電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（24V35分鐘）。
[0081]6)牛奶封閉。5%牛奶（5g奶粉+100血PBST)，室溫，搖床上封閉1小時(shí)。
[0082] 7)解育NATD-抗（1/1000 ;Millipore，#05-690)及GAPDH內(nèi)參一抗（1/20000; MBL觀171-3)，4°(：，過夜。
[0083] 8)PBST漂洗，4次，每次10分鐘，室溫?fù)u床。
[0084]9)解育與一抗相對(duì)應(yīng)種屬的二抗（1/50000 ;Sigma，#A2304)，室溫?fù)u床2小時(shí)。
[0085] 10)PBST漂洗，4次，每次10分鐘，室溫?fù)u床。
[0086] 11)加ECA發(fā)光液反應(yīng)1-2分鐘，顯影，定影，觀察結(jié)果（見圖2)。上圖：NATD蛋 白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證NATD抗體。下圖：純化NATD蛋白電泳考馬斯亮藍(lán)染色。 GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果表明該抗體是NATD特異性的抗體。
[0087] 似N-α-ac-H4抗體的制備和檢測(cè)
[0088]a)合成N-α-ac-H4 (1-14)多膚（SGRGKGGKGLGKGG)(由南京金斯瑞生物科技技術(shù) 有限公司合成）
[0089]b)N-α-ac-H4抗體委托金斯瑞公司使用合成的N-α-ac-H4 (1-14)多膚為抗原進(jìn) 行制備。
[0090]C)Westernblot檢測(cè)來鑒定此抗體（圖3)，具體實(shí)驗(yàn)步驟及條件在W上具體實(shí)施 例中有詳細(xì)描述。圖3中右圖是使用該抗體和免疫前血清分別作為一抗進(jìn)行Westernblot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Ν-α-ac-H4的含量。圖3中左圖用H4(l-14)膚段和Ν-α-ac-H4(l-14) 膚段進(jìn)行Westernblot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該抗體可W特異性檢測(cè)H4的N端乙酷化。
[00川[3]非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中NATD蛋白免疫組化分析
[009引圖4免疫組化檢測(cè)NATD蛋白在肺癌新鮮組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，IgG和匹配的正 常組織作為對(duì)照。具體實(shí)施步驟如下：
[0093]a)收集病人的腫瘤組織，福爾馬林固定后石蠟包埋，使用切片機(jī)得到石蠟切片。
[0094]b)石蠟切片脫蠟：脫蠟前應(yīng)將組織切片在室溫中放置60分鐘或60°C恒溫箱中烘 烤20分鐘。然后按順序進(jìn)行二甲苯I10分鐘一二甲苯II5分鐘，酒精梯度：100% 5分鐘 一90% 5分鐘一70% 5分鐘一50% 5分鐘，PBS洗5分鐘，3次。
[0095] C)過氧化氨封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3% &〇2 (V/V)，室溫10分鐘。PBS洗5分鐘， 3次。
[0096]d) 10% (W/V)正常羊血清室溫封閉20分鐘后加anti-NATD-抗，室溫解育2小時(shí)。 PBS洗5分鐘，3次。
[0097]e)加一抗相對(duì)應(yīng)種屬的二抗（1/50000 ;Sigma，#A2304)室溫解育1小時(shí)。PBS洗 5分鐘，3次。
[009引f)DAB顯色，終止后用自來水