一種與非小細胞肺癌輔助診斷相關的標志物及其應用
【專利說明】-種與非小細胞肺癌輔助診斷相關的標志物及其應用
[000。 專利說明
[0002] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可W對 本發(fā)明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明屬于生物技術領域，提供了對非小細胞肺癌進行檢測和診斷、預后、W及 治療的新方法。具體地說，本發(fā)明設及Ν-α-乙酷基轉移酶D(NATD)單獨或和Slug蛋白聯(lián) 合用作非小細胞肺癌特異性診斷標志物、對患有非小細胞肺癌患者進行預后、W及用作非 小細胞肺癌治療的潛在祀點的應用。
【背景技術】
[0004] 世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示全球每年約有800萬人死于癌癥，其中肺癌死亡人數(shù)高 居榜首。肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤死亡病例的22. 7%， 且發(fā)病率和死亡率仍在繼續(xù)上升。如不及時采取有效的控制措施，預計到2025年，中國的 肺癌患者人數(shù)將達到100萬，成為世界第一肺癌大國。
[0005] 肺癌可W分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-smallcelllungcancer, NSCLC)，其中后者占大約80%，是最常見的肺癌。非小細胞肺癌又可W分為Ξ類：鱗癌、腺 癌和大細胞癌。肺癌的死亡率高，五年生存率不足15%。一個重要的原因是早期診斷率極 低，不足2%，80%W上患者就診時已在晚期。目前非小細胞肺癌的診斷方法有X-射線檢 查、CT掃描、支氣管鏡檢、疲細胞學檢查W及肺癌生物標志物檢測等。現(xiàn)有的廣譜肺癌標志 物無法確診肺癌，而其他檢查方法都存在早期普查的漏檢率較高的缺陷。因此，開發(fā)新的特 異性的肺癌生物標志物用于早期診斷和治療成為當務之急。
[0006]除了診斷方法上的不足外，癌癥病人死亡率居高不下的一個重要原因是癌細胞的 遠端轉移1。事實上，90%W上的肺癌患者都死于原位腫瘤的侵襲和轉移。肺癌的轉移部 位多，轉移途徑也很多，有淋己轉移、局部直接蔓延、血行轉移和局部種植等。癌細胞的轉移 是許多生理學過程共同作用的結果。其中，上皮向間充質(zhì)轉化巧pithelial-Mesenchymal -Transition,EMT)在癌細胞的遠端轉移過程中起著非常重要的作用2 3。在腫瘤的轉移過 程中，腫瘤細胞利用EMT轉化為間充質(zhì)細胞獲得遷移和侵染能力，侵入到附近的血管中，在 體內(nèi)移動，從而到達身體的其他部位并最終形成新的病灶 4'5。EMT過程受到Slug、Snail、 Zebl、Zeb2、Twist等多個轉錄因子的調(diào)控，并且運些參與EMT過程的調(diào)節(jié)因子可W非常明 顯的影響腫瘤的形成和轉移6 1°。Slug作為E-box結合轉錄抑制子家族成員之一，可W通過 其N端的SNAG結構域與染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白LSD1結合，兩者共同發(fā)揮作用來抑制EMT標記分 子E-ca化erin的表達，進而促進EMT過程11。
[0007] 蛋白質(zhì)N端α-乙酷化在真核細胞中是一種非常普遍的蛋白修飾方式。在人的細 胞中，Ν端α-乙酷化的蛋白高達80%W上，并且運種修飾方式在進化上是保守的izM。蛋 白N端α-乙酷化是由N-α-乙酷基轉移酶（NAT)家族來催化的IS。NATO是NAT家族的第 四個成員，主要負責組蛋白H4和肥A的N端α-乙酷化1S1S。先前關于NATD的研究主要 集中在酵母中16,但是其在人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用還不清楚。迄今，尚未見有關W NATD作為標志物用于人類癌癥的檢測和祀點治療的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明第一方面設及Ν- α -乙酷基轉移酶D (NATD)或其片段、單獨或和Slug蛋白 聯(lián)合用于檢測病人是否患有非小細胞肺癌或對患有非小細胞肺癌患者進行預后的制劑中 的應用。通過測定來源于受試者的生物學樣品諸如腫瘤組織樣品中的NATD和Slug基因表 達水平或蛋白水平來實現(xiàn)，可使用獲自非癌性組織的正常細胞來作為對照樣本?；蛩?或/和蛋白表達水平與正常對照水平相比的升高表明該受試者患有非小細胞肺癌或有風 險發(fā)生非小細胞肺癌。統(tǒng)計結果還發(fā)現(xiàn)，NATD在肺癌患者腫瘤組織中的水平與肺癌病人存 活率負相關，可用作肺癌預后的指標。因此，本發(fā)明者利用實時定量PCR技術或/和免疫組 化技術，通過對NATD單獨或和Slug聯(lián)合進行定量及生物活性測量，實現(xiàn)了對對象是否患有 非小細胞肺癌的檢測W及對患有非小細胞肺癌患者進行預后。
[0009] 本發(fā)明另一方面設及篩選可抑制Ν-α -乙酷基轉移酶D(NATD)和Slug活性、作 用、及表達量的抑制物，可鑒定能抑制非小細胞肺癌侵襲和轉移的藥物，為非小細胞肺癌的 診斷和治療提供參考依據(jù)。
[0010] 本發(fā)明的目的可W通過W下技術方案實現(xiàn)：
[0011] 一種與癌細胞或腫瘤輔助診斷相關的標志物，該標志物為NATD或者NATD和Slug 的組合，所述的NATD為NATD基因或蛋白，所述的Slug為Slug基因或蛋白；該標志物優(yōu)選 為NATD基因、NATD蛋白、NATD基因和Slug基因的組合或者NATD蛋白和Slug蛋白的組 合。該標志物進一步有選為NATD基因和Slug基因的組合或者NATD蛋白和Slug蛋白的組 合；更進一步優(yōu)選為NATD蛋白和Slug蛋白的組合。
[0012] 上述的標志物在制備癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物忍片中的應用。
[0013] 上述標志物的引物或特異性抗體，該引物為所述NATD基因的實時巧光定量PCR引 物和所述Slug基因的實時巧光定量PCR引物；所述NATD基因的實時巧光定量PCR引物： 正向引物：5' -TACCTCATCGCGTGGGAAAAC-3'；反向引物：5' -GGATCTGTATGAGGAACTTCC-3,； 所述Slug基因的實時巧光定量PCR引物：正向引物：ATACCACAACCAGAGATCCTCA ;反向引物： GACTCACTCGCCCCAAAGATG；
[0014] 該特異性抗體為用于檢測NATD蛋白的表達水平和生物活性的anti-NATD和 anti-N-a -ac-H4,W及Slug蛋白的特異性抗體。
[0015] 上述標志物的引物或特異性抗體在制備癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物忍 片中的應用。
[0016] 一種癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物忍片，該試劑盒或生物忍片中包含用于 檢測血液或腫瘤組織中NATD基因表達水平或者NATD和Slug基因雙表達水平的特異性引 物；或者包含用于檢測血液或腫瘤組織中的NATD蛋白表達水平或者NATD和Slug蛋白雙表 達水平的特異性抗體。
[0017] 上述的癌細胞或腫瘤輔助診斷試劑盒或生物忍片，所述的引物為上述的引物，所 述的抗體為上述的抗體。
[0018] 上述的試劑盒或生物忍片中還包括PCR技術常用的試劑和免疫組化技術常用的 試劑。
[0019] 一種癌細胞或腫瘤侵襲和轉移的抑制物，該抑制物為NATD基因或蛋白的活性、作 用、及表達量的抑制物；優(yōu)選的該抑制物為NATD基因、NATD蛋白產(chǎn)物及其乙酷化催化活性 的抑制物；進一步優(yōu)選的該抑制物為包括抗體、化學抑制物、shRNA和miRNA抑制物W及 類似物中的至少一種；更進一步優(yōu)選的該抑制物特異性阻斷NATD的乙酷輔酶A結合位點 (RRKGLG)〇
[0020] -種^ug蛋白的活性、作用、及表達量的抑制物，該抑制物為^ug基因、別ug蛋 白產(chǎn)物及其生物活性的抑制物。優(yōu)選的所述的抑制物特異性阻斷NATD和其在Slug啟動子 (promoter)區(qū)域中作用位點的結合。優(yōu)選的所述的抑制物為由載體所表達的缺失乙酷輔酶 A結合位點的NATD蛋白。
[0021] 上述的癌細胞包括非小細胞肺癌及其他類似的上皮癌細胞巧pithelial cell cancer);所述的腫瘤包括非小細胞肺癌及其他上皮細胞腫瘤。優(yōu)選的所述的上皮細胞腫瘤 包括非小細胞肺癌、肝癌、胃癌、結直腸癌、卵巢癌、宮頸癌。尤其是非小細胞肺癌。
[0022] 本發(fā)明設及分子生物學和腫瘤藥學領域。設及NATD及其祀基因Slug在非小細胞 肺癌診斷和治療中的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)NATD在肺癌病人的腫瘤組織中表達水平顯著增高， 并且相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示NATD與病人的死亡率正相關；在H1299肺癌細胞中NATD被下調(diào)后 細胞的遷移能力受到抑制，并且導致了多個與上皮向間充質(zhì)轉化（EMT)過程相關的蛋白表 達的變化。其中，轉錄因子Slug作為EMT過程中的一個重要轉錄因子，其基因表達受到NATD 的表觀遺傳調(diào)節(jié)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)NATD可W通過調(diào)控Slug基因的表達水平參與EMT過程的調(diào) 控，進而調(diào)控癌細胞的侵襲和轉移，并且運種作用是依賴NATD的乙酷化酶活性的。NATD催 化Slug啟動子上組蛋白H4發(fā)生N端α-乙酷化從而提高Slug的表達，使細胞發(fā)生EMT轉 化。本發(fā)明表明NATD能作為非小細胞肺癌臨床診斷的潛在標志物W及對患有非小細胞肺 癌患者進行預后。同時，NATD/Slug可W作為一個潛在的祀點途徑為肺癌的治療提供新的 策略。可W通過對NATD乙酷化催化位點的阻斷、對NATD與Slug啟動子區(qū)域的結合位點的 阻斷、W及對Slug啟動子區(qū)域組蛋白的調(diào)控來抑制NATD和Slug的活性、作用、及表達量， 進而抑制非小細胞肺癌的侵襲和轉移，為非小細胞肺癌的治療提供了新的參考依據(jù)。
[0023] 本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點可通過參閱W下具體實施方案的描述并結合附圖來知 曉。
[0024] 本發(fā)明的有益效果
[0025] 本發(fā)明提供了快速簡便的非小細胞肺癌標記物的檢測方法，可W作為非小細胞肺 癌及其他上皮腫瘤早期診斷的輔助手段。此外NATD作為表觀遺傳修飾酶，可W篩選出該蛋 白特異性的抗體或小分子化合物來抑制其活性從而達到治療非小細胞肺癌及其他上皮腫 瘤病人的目的。
【附圖說明】
[0026] 圖1實時定量PCR方法檢測化tD基因在29例非小細胞肺癌病人正常組織和腫瘤 組織中的mRNA水平
[0027]圖2 anti-NATD特異性抗體的制備及檢測
[002引 圖3 anti - N- α -ac-H4特異性抗體的制備及檢測
[0029] 圖4免疫組化檢測NATD在非小細胞肺癌病人腫瘤組織切片中的蛋白水平
[0030] 圖5 NATD表達水平與肺癌病人存活率的負相關關系
[0031] 圖6 NATD knockdown的H1299細胞株制備及檢測
[0032] 圖7 NATD knockdown抑制肺癌細胞的遷移能力
[003引圖8生物巧光顯像表明NATD knockdown抑制小鼠肺癌的轉移和生長
[0034] 圖9免疫組化檢測表明NATD