的方法作為增加 aDNA測序文庫中內(nèi)源性DNA的比例的無偏工具。為了盡可能多地靶向剩余的內(nèi)源性DNA， 我們用含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的銜接子從現(xiàn)代參考個(gè)體建立了人基因組DNA"誘餌"文庫 (參見"材料與方法"部分）。然后，我們用生物素化的UTP對這些文庫執(zhí)行體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生 覆蓋整個(gè)人基因組的RNA誘餌。將誘餌雜交至溶液中的aDNA文庫并用鏈霉抗生物素蛋白 包被的磁珠拉下。隨后洗滌掉未結(jié)合的、主要是非人的DNA，并且將所捕獲的內(nèi)源性人DNA 洗脫并擴(kuò)增用于測序。圖1顯示了WISC過程的示意性概述，其包括建立RNA誘餌文庫。通 過使用由RNA制得的封閉銜接子的寡核苷酸和誘餌，我們能夠在PCR擴(kuò)增之前通過RNA酶 處理去除任何殘留的誘餌和封閉劑。
[0083] 材料和方法
[0084] 古代樣本
[0085] 在本研究中使用的四顆保加利亞人的牙是從四處不同的挖掘地獲得的。
[0086] 樣品P192-1被發(fā)現(xiàn)于保加利亞的斯維倫格勒附近的圣所坑位置，其在2004年和 2006年之間被挖掘?；谠诳又邪l(fā)現(xiàn)的陶器，發(fā)現(xiàn)該坑與色雷斯人文化有關(guān)并且追溯至早 期鐵器時(shí)代（800 - 500BC)。在挖掘過程中總共探索了 67個(gè)祭祀坑，其包括含有人骨架或 骨架的部分的16個(gè)坑。來自成年男性的上部智齒被用于DNA分析。
[0087] 樣品T2G2被發(fā)現(xiàn)于保加利亞Stambolovo的村莊附近的色雷斯人古墓（古墳）。追 溯至早期鐵器時(shí)代（850 - 700BC)的兩個(gè)小古墓在2008年被挖掘。來自在陶罐（dolium) 內(nèi)土葬的兒童（約12歲）的犬齒被用于DNA分析。
[0088] 樣品V2被發(fā)現(xiàn)于保加利亞Vratitsa的村莊附近的追溯至晚期青銅器時(shí)代 (1500 - 1100BC)的平墓地。九個(gè)土葬墳?zāi)乖?003年和2004年之間被挖掘。來自男性少 年（16 - 17歲）的臼齒被用于DNA分析。
[0089] 樣品K8被發(fā)現(xiàn)于保加利亞Krushare附近的追溯至鐵器時(shí)代（450-400BC)的 YakimovaMogila古墓。含有豐富陪葬品的貴族土葬墳?zāi)乖?008年被挖掘。
[0090] 來自一個(gè)個(gè)體（可能為男性）的臼齒被用于DNA分析。
[0091] 其它樣本如下。
[0092] 樣品M4是獲自丹麥的BorumEsh0j青銅器時(shí)代墳?zāi)沟墓糯l(fā)樣品。該墳?zāi)拱?含橡木棺材中的三個(gè)個(gè)體，一般地被稱為"女人"、"年輕人"和"老人"。M4樣品來自后者。 該位置在1871 - 1875年被挖掘并且棺材追溯至約1350BC。
[0093] 樣品NA39 - 50獲取自追溯至 1000和 1500AD之間的pre-ColumbianChachapoyan 和Chachapoya-Inca遺骸。它們回收自秘魯東北部的LagunadelosCondores位置。
[0094] 骨樣品被用于DNA分析。
[0095] DNA提取和aDNAf庫制備
[0096] 所有的DNA提取和初始文庫制備步驟（在擴(kuò)增之前）在丹麥哥本哈根的考古遺傳 學(xué)中心（CentreforGeoGenetics)的專用清潔實(shí)驗(yàn)室通過制定的防止污染的程序來進(jìn)行， 包括在文庫制備過程中使用索引銜接子和引物。
[0097] 在延長的時(shí)期內(nèi)并由許多不同的研究者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室工作，這是確切的方案在樣品 之間稍微不同的原因。
[0098] 保加利亞人樣品：
[0099] 用10%的漂白液擦拭每顆牙的表面，然后用UV照射20min。然后，切除牙根的部 分并對牙的內(nèi)部進(jìn)行鉆取以產(chǎn)生大約200mg的粉末。用先前描述的基于氧化硅的提取方法 分離DNA。
[0100] 根據(jù)制造商的說明，用NextEndPrepEnzymeMix(NewEnglandBiolabs)對 純化的DNA進(jìn)行末端修復(fù)和dA加尾。接著，通過將25μ1末端修復(fù)/dA加尾反應(yīng)物 與1μ1PE銜接子（5μΜ)和1μ1QuickT4DNA連接酶（NEB)混合來進(jìn)行與Illumina PE銜接子（Illumina)的連接。混合物在25°C孵育lOmin，然后根據(jù)制造商的說明，用 QIAGENMinElute離心柱（QIAGEN)進(jìn)行純化。最后，通過將5μ1DNA文庫模板與5μ1 10XPCR緩沖液、2μ1MgC12(50mM)、2ylBSA(20mg/ml)、0.4yldNTP(25mM)、lyl各弓| 物（ΙΟμΜ，inPE+多重索引）和 0·2μ1PlatinumTaq高保真聚合酶（Invitrogen/Life Technologies)混合來PCR擴(kuò)增文庫。PCR條件如下：94°C/5min;94°C/30s、60°C/20s、 68°C/20s的25個(gè)循環(huán)；72°C/7min。用QiaQuick離心柱（QIAGEN)純化所得到的文庫并 洗脫在30μ1EB緩沖液中。
[0101] 秘魯人骨樣品：
[0102] 通過先前描述的基于氧化硅的提取方法從七個(gè)骨樣品分離DNA。
[0103] 除了用MinElute氧化硅柱純化（QIAGEN)代替SPRI小珠純化之外，根據(jù)制造商的 說明，用NEBNextDNALibraryPrepMasterMixSetfor454 (NEB)將DNA進(jìn)一步轉(zhuǎn)換成 具有20μ1的各DNA提取物的索引11lumina文庫。將11lumina多重平末端銜接子在25μ1 的終體積、1. 0μΜ的終濃度下用于連接。在孵育20min后通過冷凍樣品滅活Bst聚合酶填充 反應(yīng)。在文庫制備之后進(jìn)行兩步PCR擴(kuò)增。純化的文庫的擴(kuò)增通過使用PlatinumTaq高保 真DNA聚合酶（Invitrogen)利用10X高保真PCR緩沖液、50mM硫酸鎂、(λ2mMdNTP、0· 5μΜ 多重卩0?引物1.0、0.1以]\1多重？0?引物2.0、0.5 4]\1?0?引物索引、3%0150、0.021]/^1 PlatinumTaq高保真聚合酶、5μ1模板和加水至25μ1終體積的最終混合物來完成。針對 各文庫完成三個(gè)PCR反應(yīng)，其PCR條件如下：94°C下的活化步驟3min，之后是94°C下30s、 60°C下20s、68°C下20s的14個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸7min。每個(gè)文庫的所有的三個(gè)反應(yīng) 用QIAGENMinElute柱純化并合并成一個(gè)單個(gè)反應(yīng)。以與之前相同的條件進(jìn)行第二PCR但 進(jìn)行22個(gè)循環(huán)。隨后用來自三個(gè)之前反應(yīng)的所純化的庫中的10μ1進(jìn)行每個(gè)文庫的一個(gè) 反應(yīng)。將文庫在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，并根據(jù)制造商的說明，用QIAGEN凝膠提取試劑 盒純化凝膠。
[0104] 丹麥人毛發(fā)樣品：
[0105] 用酚-氯仿結(jié)合之前所述的來自QIAGEN的MinElute柱從70mg毛發(fā)提取DNA。
[0106] 當(dāng)被固定在氧化硅濾器上時(shí)，將DNA依次用AW1/AW2洗滌緩沖液（QIAGEN血和組 織試劑盒）、Salton緩沖液（MPBiomedicals)和PE緩沖液（QIAGEN)進(jìn)行純化，隨后在 60μ1EB緩沖液（QIAGEN)中進(jìn)行洗脫。然后，用NEBNextDNASamplePr印MasterMix Set2 (E6070)和Illumina特異性銜接子將20μ1DNA提取物構(gòu)建至平末端NGS文庫中。 根據(jù)制造商的說明制備文庫，其中進(jìn)行下文概括的少量修飾。由于古DNA的片段化性質(zhì)，略 去初始噴霧步驟。在25μ1反應(yīng)中用20μ1DNA提取物進(jìn)行末端修復(fù)。這在12°C下孵育 20min并在37°C下孵育15min，用QIAGENMinElute離心柱以PN緩沖液純化并洗脫在15μ1 中。末端修復(fù)之后，在25μ1反應(yīng)中將Illumina特異性銜接子連接至經(jīng)末端修復(fù)的DNA。 反應(yīng)在20°C孵育15min并在QIAGENMinElute柱上以PB緩沖液進(jìn)行純化，隨后在20μ1EB 緩沖液中進(jìn)行洗脫。在25μ1的終體積中進(jìn)行銜接子填充反應(yīng)并在37°C孵育20min，隨后在 80°C孵育20min以滅活Bst酶。然后，在混合有5μ1 10XPCR緩沖液、2μ1MgS04(50mM)、 2μ1BSA(20mg/ml)、0.4yldNTP(25mM)、lyl的各引物（10μΜ，?ηΡΕ正向引物 + 多重索 引的反向引物）和〇·2μ1PlatinumTaq高保真DNA聚合酶（Invitrogen)的50μ1PCR 反應(yīng)中，擴(kuò)增和索引整個(gè)DNA文庫（25μ1)。如下進(jìn)行熱循環(huán)：95°C下5min，之后是94°C下 30s、60°C下20s和68°C下20s的25個(gè)循環(huán)，最后是在68°C下7min的延伸步驟。然后在 QIAGENMinElute柱上用PB緩沖液純化所擴(kuò)增的文庫，隨后洗脫在30μ1EB中。
[0107] RNA誘餌f庫的制備
[0108] 用T7銜接子建立人基因組DNA文庫：
[0109] 在CovarisS2儀器上使用下述條件剪切五微克人DNA(HapMap個(gè)體NA21732,馬 塞族人男性）：1〇%占空比下8min，強(qiáng)度5, 200循環(huán)/脈沖，頻率掃描。根據(jù)制造商的方案， 通過ΚΑΡΑ文庫制備試劑盒（ΚΑΡΑ)將所得到的片段化的DNA(~150 - 200bp的平均大小， 范圍100 - 500)進(jìn)行末端修復(fù)和dA加尾。還用該試劑盒執(zhí)行連接，但是用的是自定義的銜 接子。通過將12. 5μ1的各200μΜ寡核苷酸儲(chǔ)液與5μ1的10X緩沖液2 (NEB)和20μ1 Η20 混合來使Τ7 銜接子寡核苷酸 1 和 2C-GATCTTAAGGCTAGAGTACTAATACGACTCACTATAGG G*T-3， （SEQIDN0:1)和 5， -P-CCCTATAGTGAGTCGTATTAGTACTCTAGCCTTAAGATC-3，（SEQ IDNO:2))退火。將該混合物加熱至95°C進(jìn)行5min，然后置于工作臺(tái)上冷卻至室溫進(jìn)行約 lhr〇
[0110]再次根據(jù)文庫制備試劑盒說明（ΚΑΡΑ)，將一微升的該T7銜接子儲(chǔ)液用于連接反 應(yīng)。然后在2%瓊脂糖凝膠上根據(jù)大小選擇文庫，以去除未連接的銜接子并選擇長度為~ 200 - 300bp的片段（插入片段~120 - 220bp)。在用QIAquick凝膠提取試劑盒（QIAGEN) 進(jìn)行凝膠提取之后，使用下述成分在四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中PCR擴(kuò)增文庫：25μ12XHiFi HotStartReadyMix(ΚΑΡΑ)、20μ1H20、5μ1PCR引物（5'-GATCTTAAGGCTAGAGTACTAATACG ACTCACTATAGGG*T-3'，與上文的T7寡核苷酸1相同，10μΜ儲(chǔ)液）和5μ1純化的連接混合 物。循環(huán)條件如下：98°C/lmin，98°C/15s;60°C/15s、72°C/30s的 10 個(gè)循環(huán)；72°C/5min。 合并反應(yīng)并用AMPureXP珠（BeckmanCoulter)進(jìn)行純化，洗脫在25μ1H20中。
[0111] 誘餌文庫的體外轉(zhuǎn)錄：
[0112] 為了將誘餌文庫轉(zhuǎn)錄為生物素化的RNA，我們組合了以下體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混 合物：5μ1擴(kuò)增的文庫（~500ng)、15. 2μ1H20、10μ1 5XNASBA緩沖液（185mM Tris-HCl[pH8. 5],93mMMgC12, 185mMKC1, 46%DMS0) ^2. 5μ1 0. 1MDTT^O. 5μ1 10mg/ mlBSA、12. 5μllOmMNTP混合物（lOmMATP,lOmMCTP,lOmMGTP, 6. 5mMUTP, 3. 5mM生物 素-16-UTP)、1. 5μ1T7RNA聚合酶（20U/μ1,Roche)、0· 3μ1焦磷酸酶（0·1U/μ1,NEB)和 2· 5μ1SUPERase-InRNA酶抑制劑（20U/μ1,LifeTechnologies)。反應(yīng)在37°C下孵育過 夜，在 37°C用ΙμLTURBODNA酶（2υ/μ1,LifeTechnologies)處理 15min，然后根據(jù)制造 商的說明使用RNeasyMini試劑盒（QIAGEN)進(jìn)行純化，在相同的30μ1H20中洗脫兩次。 單個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生~50μg的RNA。通過在5%TBE/尿素凝膠上電泳~100ng并用溴化乙錠染 色來核對RNA的大小。對于長期儲(chǔ)存，加入1. 5μ1SUPERase-In，并將RNA儲(chǔ)存于-80°C。
[0113] 封閉銜接子的RNA寡核苷酸的制備
[0114] 用于測試富集方案的所有aDNA文庫含有索引的多重銜接子（參見上文的"DNA提 取和文庫制備"部分）。為了封閉這些序列并防止捕