ar Cloning:ALaboratoryManual，第 3 版，2001ColdSpringHarbor,N.Y·)。高嚴(yán)格條件的 一個實例包括在約42°C下在50%甲酰胺、5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5%SDS和100yg/ ml變性的載體DNA中雜交，然后在室溫下在2XSSC和0. 5%SDS中洗滌兩次，再在42°C下 在0.IXSSC和0. 5%SDS中洗滌兩次。
[0031] 本文使用的術(shù)語"雙鏈體"或"雙鏈的"描述堿基配對即雜交到一起的兩個互補多 核苷酸。
[0032] 本文使用的術(shù)語"擴增"是指使用靶標(biāo)核酸作為模板生成靶標(biāo)核酸的一個或更多 個拷貝。
[0033] 術(shù)語"確定"、"測量"、"評價"、"評估"、"測定"和"分析"在本文可互換使用以指代 任何形式的測量，并包括測定某一要素是否存在。這些術(shù)語包括定量和/或定性測定。評 估可以是相對的或絕對的。"評估...的存在"包括測定存在的某物的量，以及測定其是存 在還是不存在。
[0034] 術(shù)語"使用"具有其常規(guī)含義，并因此意指采用（例如投入使用）方法或組合物以 實現(xiàn)目的。例如，如果使用程序以生成文件，則執(zhí)行程序以制作文件，該文件通常為該程序 的輸出。在另一個實例中，如果使用計算機文件，則通常訪問、讀取該文件，并將該文件中存 儲的信息用于實現(xiàn)目的。相似地，如果使用獨特的標(biāo)識符例如條形碼，則通常讀取該獨特的 標(biāo)識符以識別例如與該獨特的標(biāo)識符相關(guān)的物體或文件。
[0035] 本文使用的術(shù)語"T/是指寡核苷酸雙鏈體的解鏈溫度，在該溫度下，雙鏈體的一 半保持雜交，并且雙鏈體的一半解離成單鏈。寡核苷酸雙鏈體的可以通過實驗測定或 使用下式預(yù)測：!'"1=81.5+16.6(1呢1。[似+])+0.41(6+(：分?jǐn)?shù)）-(60/吣，其中~為鏈長度， 并且[Na+]小于1M。參見Sambrook和Russell (2001 ;Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor Ν· Υ·，第10章）。還存 在預(yù)測寡核苷酸雙鏈體1的其它公式，一個公式對于給定的條件或一組條件可以是或多或 少地合適的。
[0036] 關(guān)于基因組，術(shù)語"劃分（partitioning) "是指基因組的一部分與基因組的其余部 分分離以產(chǎn)生與基因組的其余部分分離的產(chǎn)物。術(shù)語"劃分"涵蓋富集。
[0037] 本文使用的術(shù)語"基因組區(qū)域"是指基因組的區(qū)域，例如動物或植物基因組諸如 人、猴、大鼠、魚或昆蟲或植物的基因組的區(qū)域。在某些情況下，在本文所述的方法中使用的 寡核苷酸可使用參考基因組區(qū)域（即，已知核苷酸序列的基因組區(qū)域，例如，其序列保存在 例如NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫或其它數(shù)據(jù)庫中的染色體區(qū)域）來設(shè)計。
[0038] 本文使用的術(shù)語"基因組序列"是指出現(xiàn)在基因組中的序列。由于RNA由基因組 轉(zhuǎn)錄，因此，該術(shù)語涵蓋存在于生物體的核基因組中的序列，以及存在于由這樣的基因組轉(zhuǎn) 錄的RNA(例如mRNA)的cDNA拷貝中的序列。
[0039] 本文使用的術(shù)語"基因組片段"是指基因組的區(qū)域，例如動物或植物基因組，諸如 人、猴、大鼠、魚或昆蟲或植物的基因組的區(qū)域?；蚪M片段可以是整個染色體或染色體的 片段?；蚪M片段可以是銜接子連接的（在此情況下，其具有連接至片段一個或兩個末端、 或連接至至少分子的5'末端的銜接子），或可以不是銜接子連接的。
[0040] 在某些情況下，用于本文所述的方法的寡核苷酸可使用參考基因組區(qū)域（即，已 知核苷酸序列的基因組區(qū)域，例如，其序列保存在例如NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫或其它數(shù)據(jù) 庫中的染色體區(qū)域）來設(shè)計。這樣的寡核苷酸可用在使用含有測試基因組的樣品的測定法 中，其中該測試基因組含有針對該寡核苷酸的結(jié)合位點。
[0041] 本文使用的術(shù)語"生物素部分"是指包含生物素或生物素類似物諸如脫硫生物 素、氧代生物素、2-亞氨基生物素、二氨基生物素、生物素亞砜、生物胞素等的親和劑。生物 素部分以至少10SM的親和力與鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合。生物素親和劑還可包含接頭，例 如-LC-生物素、-LC-LC-生物素、-SLC-生物素或-PEGn-生物素，其中η為3-12。
[0042] 本文使用的術(shù)語"連接"是指第一DNA分子的5'末端上的末端核苷酸與第二DNA 分子的3'末端上的末端核苷酸的酶催化結(jié)合。轉(zhuǎn)座酶可以催化連接。
[0043] "多個"包含至少2個成員。在某些情況下，"多個"可具有至少10個、至少100個、 至少100個、至少10, 000個、至少100, 000個、至少106個、至少10 7個、至少10 8或至少10 9 個或更多個成員。
[0044] 如果兩個核酸為"互補的"，則該核酸之一的每個堿基與另一核酸中的對應(yīng)核苷酸 堿基配對。兩個核酸無需完美互補以彼此雜交。
[0045] 本文使用的術(shù)語"分離"是指兩種元件的物理分離（例如，通過尺寸或親和力等）， 以及使一種元件降解而留下另一個完整無損。
[0046] 在細(xì)胞中，DNA通常以雙鏈的形式存在，并因此具有核酸的兩條互補鏈，在本文中 被稱為"上"鏈和"下"鏈。在某些情況下，染色體區(qū)域的互補鏈可以被稱為"正"鏈和"負(fù)" 鏈、"第一"鏈和"第二"鏈、"編碼"鏈和"非編碼"鏈、"沃森"鏈與"克里克"鏈、或"有義"鏈 和"反義"鏈。將鏈分配為上鏈或下鏈?zhǔn)侨我獾?，并且不暗示任何特定的方向、功能或結(jié)構(gòu)。 第一鏈和第二鏈?zhǔn)遣煌姆肿樱钡剿鼈冏兂晒矁r連接為止。為了便于描述，其中上鏈和下 鏈已共價連接的雙鏈核酸的"上"鏈和"下"鏈將仍被描述為"上"鏈和"下"鏈。換句話說， 為了本公開內(nèi)容的目的，雙鏈DNA的上鏈和下鏈不需要是單獨的分子。幾個示例性哺乳動 物染色體區(qū)域（例如，BAC、裝配體、染色體等）的第一鏈的核苷酸序列是已知的，并可見于 例如NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中。
[0047] 本文使用的術(shù)語"上鏈"是指核酸的任一鏈而不是核酸的兩條鏈。當(dāng)寡核苷酸或 引物"僅與上鏈"結(jié)合或退火時，它僅與一條鏈結(jié)合而不與另一條鏈結(jié)合。本文使用的術(shù)語 "下鏈"是指與"上鏈"互補的鏈。當(dāng)寡核苷酸"僅與一條鏈"結(jié)合或退火時，它僅與一條鏈 例如第一鏈或第二鏈結(jié)合，而不與另一條鏈結(jié)合。如果寡核苷酸與雙鏈DNA的兩條鏈結(jié)合 或退火，則該寡核苷酸可以具有兩個區(qū)域，第一區(qū)域與雙鏈DNA的上鏈雜交，以及第二區(qū)域 與雙鏈DNA的下鏈雜交。
[0048] 術(shù)語"雙鏈DNA分子"是指其中上鏈和下鏈沒有共價連接的雙鏈DNA分子以及其 中上鏈和下鏈共價連接的雙鏈DNA分子。雙鏈DNA的上鏈和下鏈通過沃森-克里克相互作 用彼此堿基配對。
[0049] 本文使用的術(shù)語"變性"是指通過將雙鏈體置于合適的變性條件中來分離核酸雙 鏈體的堿基對的至少一部分。變性條件是本領(lǐng)域公知的。在一個實施方案中，為了變性核 酸雙鏈體，可將雙鏈體暴露于在雙鏈體的！以上的溫度，從而從雙鏈體的一條鏈釋放另一 條鏈。在某些實施方案中，核酸可以通過將其暴露于至少90°C溫度進(jìn)行合適的時間量（例 如，至少30秒，多至30分鐘）進(jìn)行變性。在某些實施方案中，完全變性條件可以用于完全 分離雙鏈體的堿基對。在其它實施方案中，部分變性條件（例如使用比完全變性條件低的 溫度）可以用于分離雙鏈體的某些部分的堿基對（例如富含A-T堿基對的區(qū)域可以分離而 富含G-C堿基對的區(qū)域可以保持配對）。還可以化學(xué)變性核酸（例如，使用尿素或NaOH)。
[0050] 本文使用的術(shù)語"基因分型"是指核酸序列的任何類型的分析，并且包括測序、多 態(tài)性（SNP)分析以及鑒定重排的分析。
[0051] 本文使用的術(shù)語"測序"是指通過其獲得多核苷酸的至少10個連續(xù)核苷酸的身份 (例如，至少20個、至少50個、至少100個或至少200個或更多個連續(xù)核苷酸的身份）的方 法。
[0052] 術(shù)語"下一代測序"是指目前由Illumina、LifeTechnologies和Roche等采用的 所謂的并行合成測序或連接測序平臺。下一代測序法還可包括納米孔測序法或基于電子檢 測的方法，諸如由LifeTechnologies商業(yè)化的離子激流技術(shù)。
[0053] 術(shù)語"內(nèi)源性DNA"是指存在于樣品（例如，牙、骨、毛發(fā)或骨骼的樣品）中的當(dāng)樣 品是活體的一部分時與樣品天然關(guān)聯(lián)的DNA。
[0054] 術(shù)語"環(huán)境DNA"是指存在于樣品（例如，牙、骨、毛發(fā)或骨骼的樣品）中的當(dāng)樣品 是活體的一部分時不與樣品天然關(guān)聯(lián)的DNA。環(huán)境DNA可以來自各種來源，包括但不限于污 染樣品的微生物。在某些情況下，污染性DNA可以是來自隨時間生長在樣品上或樣品中的 微生物的基因組DNA。在其它情況下，樣品可以是已置于含有顯著量的污染性DNA的環(huán)境 (例如土壤或糞便）中的。
[0055] 術(shù)語"參考基因組DNA"是指來自目標(biāo)物種的基因組DNA。目標(biāo)物種可以是原核的 或真核的（包括動物（例如哺乳動物）、植物和細(xì)菌）物種。選擇參考基因組DNA以使得其 在高嚴(yán)格條件下與內(nèi)源性DNA而不是環(huán)境DNA雜交。
[0056] 術(shù)語"銜接子"是指可與雙鏈DNA分子的兩條鏈連接的核酸。在一個實施方案中， 銜接子可以是發(fā)夾銜接子（即，與其自身堿基配對以形成具有雙鏈的莖和環(huán)的一種分子， 其中該分子的3'端和5'端分別與雙鏈DNA分子的5'端和3'端連接）。在另一個實施方 案中，銜接子可以是Y銜接子。在另一個實施方案中，銜接子可以本身由彼此堿基配對的 兩個不同的寡核苷酸分子組成。將顯而易見的是，銜接子的可連接末端可以被設(shè)計成與由 限制性酶切割形成的懸垂（overhang)相容，或者它可以具有平末端或5'T懸垂。術(shù)語"銜 接子"是指雙鏈的以及單鏈的分子。銜接子可以是DNA或RNA，或者這兩者的混合物。含有 RNA的銜接子可以通過RNA酶處理或堿水解切割。銜接子可以為15至100個堿基，例如50 至70個堿基，盡管還考慮到此范圍之外的銜接子。
[0057] 本文使用的術(shù)語"銜接子連接的"是指已連接至銜接子的核酸。銜接子可以連接 至核酸分子的5'末端和/或3'末端。
[0058] 術(shù)語"通用銜接子"是指連接至所研究的核酸分子的兩個末端的銜接子。在某些 實施方案中，通用銜接子可以是Y銜接子。已在兩個末端連接至Y銜接子的核酸分子的擴 增得到不對稱標(biāo)記的核酸，即具有含有一種標(biāo)記序列的5'端和含有另一種標(biāo)記序列的3' 端的核酸。
[0059] 術(shù)語"Y銜接子"是指這樣的銜接子，其含有：雙鏈區(qū)域和其中寡核苷酸不互補的 單鏈區(qū)域。雙鏈區(qū)域的末端連接至靶標(biāo)分子，諸如基因組DNA的雙鏈片段。已連接至Y銜 接子的銜接子標(biāo)記的雙鏈DNA的每條鏈?zhǔn)遣粚ΨQ標(biāo)記的，因為它在一端具有Y銜接子的一 條鏈的序列而在另一端具有Y銜接子的另一條鏈的序列。
[0060] 術(shù)語"RNA啟動子銜接子"是指含有用于噬菌體RNA聚合酶（例如來自噬菌體T3、 T7、SP6等的RNA聚合酶）的啟動子的銜接子。
[0061] 術(shù)語"親和標(biāo)記"和"捕獲劑"是指這樣的部分，其能夠：a)特異性地、非共價地彼 此結(jié)合，或者b)選擇性地彼此反應(yīng)以形成共價鍵。適當(dāng)?shù)奶禺愋缘?、非共價地彼此結(jié)合的 親和標(biāo)記和捕獲劑的配對的實例有許多并且包括但不限于：鏈霉抗生物素蛋白/抗生物素 蛋白，地高辛/抗地高辛抗體，熒光素/抗熒光素抗體，盡管還已知許多其它的。選擇性地彼 此反應(yīng)以形成共價鍵的化學(xué)選擇性反應(yīng)基團(tuán)的實例有許多并包括：胺和活性酯（諸如NHS 酯，硫醇和馬來酰亞胺或碘乙酰胺），以及能夠通過點擊化學(xué)（Clickchemistry)彼此反應(yīng) 的基團(tuán)，例如疊氮和炔基團(tuán)。含有能夠用于本文的親和標(biāo)記的核糖核苷酸可商購自許多來 源。
[0062] 術(shù)語"生物素化的核糖核苷酸"是指連接至生物素部分的核糖核苷酸三磷酸（例 如ATP、GTP、CTP和UTP)。Bio-16-UTP(生物素-16-尿苷-5' -三磷酸）是生物素化的核 糖核苷酸的實例，其能夠代替UTP用于由T3、T7或SP6RNA聚合酶催化的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0063] 其它術(shù)語定義可出現(xiàn)在整個說明書中。
[0064] 示例件實施方案的詳沐
[0065] 方法的一個實例示于圖1中。在某些實施方案中，方法可以通過從包含內(nèi)源性DNA 和環(huán)境DNA的樣品中提取DNA開始，以產(chǎn)生提取的DNA。在這些實施方案中，所提取的DNA 可以包含比內(nèi)源性DNA更多的環(huán)境DNA(至少2倍、至少5