一種改造調(diào)控因子降低酵母尿素積累的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種改造調(diào)控因子降低酵母尿素積累的方法，屬于微生物遺傳和分子 生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙酯被認(rèn)為是一種對(duì)人有潛在致癌性的物質(zhì)，并在1974年被國(guó)際癌癥 研究機(jī)構(gòu)（IARC)劃為2B級(jí)的致癌化合物。此后，研究人員又發(fā)現(xiàn)氨基甲酸乙酯也可以直 接誘發(fā)人的肝癌，進(jìn)一步促使IARC在2007年將氨基甲酸乙酯的致癌等級(jí)由2B級(jí)提升到了 2A級(jí)（與甲醛同級(jí)）。而黃酒中的氨基甲酸乙酯，已經(jīng)成為危害消費(fèi)者健康和影響其市場(chǎng) 競(jìng)爭(zhēng)力的重要隱患。
[0003] 在清酒和黃酒中，由釀酒酵母代謝產(chǎn)生的尿素都是氨基甲酸乙酯最主要的前體物 質(zhì)。在發(fā)酵過(guò)程中，酵母細(xì)胞內(nèi)的尿素主要由精氨酸代謝產(chǎn)生。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)酵母偏 好型氮源（谷氨酰胺、天冬酰胺等）存在時(shí)，尿素可以進(jìn)一步被尿素水解酶降解為二氧化碳 和氨。但當(dāng)酵母偏好型氮源存在時(shí)，尿素水解酶的表達(dá)會(huì)受到強(qiáng)烈的抑制。這種現(xiàn)象由釀 酒酵母的氮源阻遏效應(yīng)（Nitrogencataboliterepression，簡(jiǎn)稱NCR)調(diào)控，可以保證酵母 細(xì)胞能在復(fù)雜的生存環(huán)境中優(yōu)先利用最利于其生存的氮源。NCR效應(yīng)的調(diào)控會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì) 胞內(nèi)高濃度尿素的積累。由于尿素對(duì)釀酒酵母細(xì)胞有毒害作用，因此細(xì)胞通過(guò)尿素透性酶 以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞綄⒛蛩剞D(zhuǎn)運(yùn)至胞外。在胞外的發(fā)酵液中，尿素可以在發(fā)酵的過(guò)程中自發(fā) 的和乙醇反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯。
[0004] NCR效應(yīng)相關(guān)的全局性調(diào)控因子主要有：四個(gè)GATA家族調(diào)控因子（Gln3p、Gatlp、 Gzf3p和Dal80p)和Ure2p。其中Gln3p和Gatlp是正調(diào)控因子，Gzf3p和Dal80p是負(fù)調(diào)控 因子，而Ure2p則是一個(gè)可以與Gln3p和Gatlp相結(jié)合的阻遏蛋白。在釀酒酵母中，Gln3p 和Gatlp能否發(fā)揮其功能與它們?cè)诎麅?nèi)的定位密切相關(guān)，只有當(dāng)這兩個(gè)激活因子被轉(zhuǎn)運(yùn)至 細(xì)胞核內(nèi)時(shí)，它們才能激活尿素代謝相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)這兩個(gè)調(diào)控因子胞內(nèi)定位的調(diào)控 與它們蛋白序列上的核定位序列和核定位調(diào)控序列密切相關(guān)。Gln3p和Gatlp的核定位序 列和核定位調(diào)控序列是釀酒酵母NCR效應(yīng)重要的調(diào)控開關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的問題是提供一種通過(guò)改造氮代謝物阻遏效應(yīng)調(diào)控因子，降低釀酒 酵母發(fā)酵過(guò)程中尿素積累的方法。通過(guò)這種遺傳改造，可以從根本上減少釀酒酵母發(fā)酵過(guò) 程中尿素的積累。
[0006] 本發(fā)明的降低酵母尿素積累的方法，是對(duì)氮代謝物阻遏效應(yīng)相關(guān)調(diào)控因子Gln3p 或Gatlp進(jìn)行改造。
[0007] 所述改造是消除調(diào)控因子Gln3p或Gatlp的核定位調(diào)控序列并突變核定位序列上 的磷酸化位點(diǎn)。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述改造是將氨基酸序列為SEQIDNO. 1的Gln3p 的位于654-667位氨基酸的核定位調(diào)控序列消除，并將第344位、第347位和第355位的絲 氨酸突變?yōu)楸彼帷?br>[0009] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述改造是將氨基酸序列為SEQIDN0. 2的Gatlp 的位于376-510位氨基酸的核定位調(diào)控序列消除，并將第360位和第361位的絲氨酸突變 為丙氨酸。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是將Gln3p或Gatlp進(jìn)行改造后的基因序 列連接到表達(dá)載體上得到重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主酵母中進(jìn)行表達(dá)。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體是pYX212。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酵母是釀酒酵母。
[0013] 本發(fā)明還提供一種尿素積累能力降低的酵母，所述酵母是將氨基酸序列為SEQID NO. 1的Gln3p或SEQIDNO. 2的Gatlp進(jìn)行改造后的基因序列連接到表達(dá)載體上得到重組 質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主酵母中而得到的。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述改造是將Gln3p的第654-667位氨基酸消除并 將第344位、347位、355位的絲氨酸突變?yōu)楸彼?，或者是將Gatlp的第376-510位氨基酸 消除并將第360、361位的絲氨酸突變?yōu)楸彼帷?br>[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酵母，具體構(gòu)建方法是：⑴對(duì)Gln3p或 Gatlp的核定位調(diào)控序列進(jìn)行消除：將相應(yīng)截短后的基因連接到表達(dá)載體pYX212,得到 重組質(zhì)粒pYX212-Gln3Pl653或pYX212-Gatlpi375;⑵對(duì)Gln3p和Gatlp的核定位序列 上的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行突變：將質(zhì)粒pYX212-Gln3Pl653或pYX212-Gatlp1375上的GLN3和 GAT1基因相應(yīng)磷酸化位點(diǎn)基因突變，得到重組質(zhì)粒pYX212-Gln3Pl653,, S344A,s347A, S355A和 pYXSU-GatlPi375,S36QA,s361A; (3)將上一步得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主酵母中進(jìn)行表達(dá)。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述酵母，是釀酒酵母菌株為CEN.PK2_lC(MATa; ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112 ;his3A1 ;MAL2-8c;SUC2)單倍體模式菌株。
[0017] 本發(fā)明所述的尿素積累減少，指的是基因工程菌株相對(duì)于野生菌株，在偏好型氮 源阻遏培養(yǎng)基中尿素的積累情況。
[0018] 本發(fā)明的有益之處：本發(fā)明對(duì)釀酒酵母氮代謝物阻遏效應(yīng)相關(guān)調(diào)控因子進(jìn)行了遺 傳改造，通過(guò)對(duì)2個(gè)不同的調(diào)控因子的改造，尿素積累量分別減少了 37. 4%和44. 3%。通 過(guò)對(duì)釀酒酵母的這種遺傳改造，可以從根本上較少釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程中尿素的積累。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1 :代謝改造Gln3p和Gatlp對(duì)菌株尿素利用情況的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 尿素和氨基酸的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)：KnorstMT,NeubertR,Wohlrab ff.Analyticalmethodsformeasuringureainpharmaceuticalformulations.Journal ofPharmaceuticalandBiomedicalAnalysis15, 1627-1632 (1997)〇
[0021] 材料與方法
[0022] 本發(fā)明所用釀酒酵母菌株為CEN.PK2-lC(MATa;ura3-52 ;trpl-289 ;leu2-3_112; his3Al;MAL2-8%SUC2)單倍體模式菌株，其他操作均為常規(guī)分子生物學(xué)操作。
[0023] 大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基，釀酒酵母的活化使用YH)培養(yǎng)基，釀酒酵母尿素 利用情況使用使用偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基的配方如下。
[0024] LB培養(yǎng)基dOg.L1 蛋白胨，5g.L1 酵母浸膏，lOg.L1NaCl，pH7.4。篩選E.coli JM109轉(zhuǎn)化子時(shí)，培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素100μg·mLS
[0025] YPD培養(yǎng)基：20g·L1蛋白胨，lOg·L1酉孝母浸膏，20g·L1葡萄糖；
[0026] 偏好型氮源阻遏培養(yǎng)基：1. 7g*L1YNB合成培養(yǎng)基（無(wú)氨基酸和硫酸銨），20g*L1 葡萄糖，lOmmol·L1谷氨酰胺，lOmmol·L1 (尿素或其他單一的非偏好型氮源）。培養(yǎng)不同 的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因工