一種名為茶山奈苷b的黃酮氧苷類化合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種名為茶山奈苷B的黃酮氧苷類化合物及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 山茶屬植物茶（Camelliasinensis)及其葉部加工產(chǎn)品如綠茶、紅茶、黑茶等中均 含有具有良好生物活性的黃酮和黃酮苷類化合物，它們是自然界中很重要的一類天然有機(jī) 化合物。早在1991年Finger等就從茶鮮葉、紅茶、綠茶中分別鑒定出20種黃酮醇及其糖 苷，鄒艷麗等也從普洱熟茶中分離得到三個(gè)黃酮類化合物。因此，說明茶產(chǎn)品中含有很多具 有預(yù)防心血管疾病、抗菌、抗癌等功效的黃酮類活性生物成分，這些具有保健功效的天然成 分備受人們關(guān)注，這也將成為醫(yī)藥研究領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0003] 茯磚茶（Fuzhuanbricktea)是黑茶的一種，其制作已有一百多年的歷史。該茶 是以茶樹的葉為原料，經(jīng)過渥堆、壓制、發(fā)花后制得。其中在渥堆發(fā)酵過程中形成了茯磚茶 特有的"金花"，因此，在香氣方面形成了其獨(dú)特的"菌花香"。茯磚茶主要產(chǎn)于我國(guó)湖南和 陜西兩省，現(xiàn)廣泛銷往全國(guó)各地和東南亞地區(qū)。這種茶除了作為茶飲料使用外，還可用于降 脂降壓、降血糖、治療菌痢等用途（見下方文獻(xiàn)）。
[0004] [1]邢志華，佟啟鵬，趙宇，閆錦.綠茶類黃酮生物活性研究進(jìn)展.藥學(xué)與臨床， 2013,4(7).
[0005] [2]侯冬巖，回瑞華，楊梅.綠茶及其飲料中總黃酮的分析.分析實(shí)驗(yàn)室，2003， 22(6) :86-88.
[0006] [3]鄒艷麗，董寶生，張伏全.普洱熟茶化學(xué)成分研究.云南化工.2009， (2) :10-13.
[0007] [4]傅東和，劉仲華，黃建安，龔雨順，陳金華.高通量篩選研究茯磚茶降脂功 效·茶葉科學(xué)，2006, 26 (3) :209-214.
[0008] [5]侯凱東·茯磚茶市場(chǎng)與收藏前景廣闊誘人·茶葉經(jīng)濟(jì)信息，2006，（7) : 12-15.
[0009] 茯磚茶因其加工過程中有微生物參與而發(fā)生了復(fù)雜變化，這些變化也許會(huì)產(chǎn)生某 些具有特殊藥理作用的新化合物。目前對(duì)于茯磚茶生物活性的化學(xué)基礎(chǔ)的報(bào)道還比較少， 若能成功的從茯磚茶這一黑茶資源中研究開發(fā)出具有生物活性的黃酮糖苷類化合物成分， 將對(duì)農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域作出重要貢獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的之一是提供了一種名為茶山奈苷B的黃酮氧苷類化合物，此名為茶 山奈苷B(camellikaempferoside B)的黃酮氧苷類化合物具有如下結(jié)構(gòu)：
[0011]
[0012] 本發(fā)明的目的之二是提供一種上述名為茶山奈苷B的黃酮氧苷類化合物的制備 方法，其包括以下步驟：
[0013] 1)、取茯磚茶，并將茯磚茶粉碎；
[0014] 2)、將粉碎后的茯磚茶用70wt%的丙酮溶液浸泡72小時(shí)，或者將粉碎后的茯磚茶 用70wt%的丙酮溶液浸泡后超聲波振蕩提取，并將提取液經(jīng)過減壓濃縮制得膏狀提取物；
[0015] 3)、將所述膏狀提取物懸浮于水中得到水混懸液，再用石油醚、氯仿、正丁醇依次 萃取，將最終得到的正丁醇萃取液減壓濃縮至膏狀；
[0016] 4)、將所述膏狀體用熱水溶解得到溶解液，接著利用羥丙基凝膠柱層析即 SephadexLH-20凝膠柱層析；將溶解液使用甲醇-水體積比0:100到100:0作為梯度洗脫， 收集其中甲醇-水體積比20:80到40:60間的洗脫組分；將得到的洗脫組分使用MCI柱層 析純化，以甲醇-水體積比0:100到100:0作為梯度洗脫，分別收集相應(yīng)體積比間的洗脫 組分，將其中甲醇-水體積比70:30洗脫得到的組分再經(jīng)過聚酰胺柱層析以丙酮-水體積 比1:2洗脫，每20mL收集一個(gè)餾分，將其中的第9~17組餾分合并、蒸干，最后經(jīng)過0DS反 相硅膠柱層析即十八烷基鍵合硅膠柱層析，以甲醇-水體積比5:4洗脫，每20mL收集一個(gè) 餾分，取其中第20~25餾分合并、蒸干，可得到茶山奈苷B。
[0017] 本發(fā)明的目的之三是提供一種上述名為茶山奈苷B的黃酮氧苷類化合物在制備 抗阿爾茨海默病藥物方面的應(yīng)用。
[0018]通過試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明提供的名為茶山奈苷B的黃酮氧苷類化合物抑制β-淀粉 樣蛋白（Αβ)的產(chǎn)生和Αβ的聚集，從而進(jìn)一步抑制Αβ引起的一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，可 以應(yīng)用于制備抗阿茨海默病藥物方面。
[0019] 具體的，本發(fā)明中的所述名為茶山奈苷Β的黃酮氧苷類化合物可以和藥學(xué)上所通 用的輔料制成口服、外用、注射等劑型，例如片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑等口服藥劑；栓 劑、徐劑、洗劑、膏劑、透皮貼劑等外用藥劑；注射液、混懸液、凍干粉末等注射藥劑，參照制 藥領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
[0020] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0021] 1)、本發(fā)明成功的從茯磚茶這一黑茶資源中研究開發(fā)出具有生物活性的黃酮糖苷 類化合物成分，對(duì)農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重大的意義。
[0022] 2)、本發(fā)明從茯磚茶中制備得到一個(gè)具有生物活性的黃酮氧苷類化合物茶山奈苷 Β，為有效開發(fā)利用茯磚茶提供了廣闊的前景。
[0023] 3)、本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，采用常規(guī)的有機(jī)提純步驟即可，有利于降低制備成本。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明茶山奈苷B(camellikaempferoside B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。
[0025] 圖2A、2B為本發(fā)明茶山奈苷B抑制Αβ產(chǎn)生的試驗(yàn)圖。
[0026] 圖3Α~3C為茶山奈苷Β抑制Αβ聚集成纖維的對(duì)照試驗(yàn)圖。
[0027] 圖4Α~4D為茶山奈苷Β促進(jìn)異常Αβ寡聚體形成的對(duì)比試驗(yàn)圖。
[0028] 圖5Α~5C為茶山奈苷Β抑制Αβ引起的ΗΤ22海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡的對(duì)比試驗(yàn) 圖。
[0029] 圖6Α、6Β為茶山奈苷Β抑制Αβ弓丨起原代小膠質(zhì)細(xì)胞激活及炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的對(duì)照 試驗(yàn)圖。
[0030] 圖7為茶山奈苷Β抑制Αβ弓丨起小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的對(duì)照試驗(yàn)圖。
[0031] 注：附圖中的YCF-2為茶山奈苷Β。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描 述。
[0033] 本發(fā)明中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0034]本發(fā)明中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
[0035] 一、茶山奈昔B(camellikaempferosideΒ)
[0036]
[0037]二、茶山奈苷B(camellikaempferosideB)的制備
[0038] (1)取3. 6公斤茯磚茶，并將茯磚茶粉碎；
[0039] (2)每次用6升70wt%的丙酮水溶液浸提粉碎后的茯磚茶，每次浸泡72小時(shí)，共 浸提3次。將所得丙酮水提取液濃縮至膏狀，得浸膏800克；
[0040] (3)將上述所得浸膏懸浮于2L水中得到水混懸液，該水混懸液先用2L的石油醚依 次萃取3次后得到的第一次剩余水混懸液即為萃取過石油醚的水混懸液，經(jīng)減壓濃縮得到 石油醚部分浸膏50克；
[0041] 將萃取過石油醚的水混懸液再用2L的氯仿依次萃取3次后得到的第二次剩余水 混懸液即為萃取過氯仿的水混懸液，經(jīng)減壓濃縮得到氯仿部分浸膏460克；
[0042] 將萃取過氯仿的水混懸液再用2L的正丁醇依次萃取3次，取正丁醇萃取液待用；
[0043] 將所述正丁醇萃取液減壓濃縮至膏狀500克，然后用500mL熱水溶解，再通過 SephadexLH-20凝膠柱層析，使用甲醇水體積比0:100到100:0梯度洗脫，收集其中甲醇 水體積比20:80到40:60間的洗脫組分，然后使用MCI柱層析分離純化，以甲醇-水體積比 0:100到100:0作為梯度洗脫，分別收集相應(yīng)體積比間的洗脫組分，將其中甲醇-水體積比 70:30洗脫得到的組分經(jīng)過聚酰胺柱層析以丙酮-水體積比1:2洗脫，每20mL收集一個(gè)餾 分，將編號(hào)9-17餾分合并、蒸干，然后再經(jīng)0DS反相硅膠柱層析即十八烷基鍵合硅膠柱層 析，以甲醇-水體積比5:4洗脫，每20mL收集一個(gè)餾分，取其中第20~25餾分合并、蒸干， 可得到茶山奈苷B(8.6毫克）。
[0044] 產(chǎn)物茶山奈苷B的特性如下：
[0045]1)、可溶于甲醇和DMS0,黃色松散粉末，
[0046] 2),υνχ^Γηη[1 (loge) :211(2.65),268(2.40),314(2.53)；
[0047] 3)、IR(KBr)VmJcm1) :3380,2918, 2850,1697, 1649,1604, 1506,1358, 1246， 1174,1133,1062,981，834,670,599,577,482,439 ;
[0048] 4)、HRESI-MS:m/z885. 2424([M-H]，C42H45021 的理論計(jì)算值為 885. 2459);核磁 共振光譜數(shù)據(jù)見表1。
[0049] 表1:茶山奈苷B的核磁共振光譜數(shù)據(jù)（?NMR在400MHz，13CNMR在100MHz條件 下測(cè)試，S單位為ppm，耦合常數(shù)J單位為Hz，溶劑為氘代DMS0)。
[0050]
[0051]

[0052] a，b，c，d信號(hào)重疊
[0053] 所有波譜數(shù)據(jù)均通過i^HCOSY，HSQC和HMBC等二維核磁共振譜歸屬，證明了所得 化合物的結(jié)構(gòu)。
[0054] 三、茶山奈苷B(camellikaempferoside B)抗阿茨海默病體外活性試驗(yàn)
[0055] 根據(jù)阿茨海默病的發(fā)病原理，治療該病的方法應(yīng)該是減少Αβ的產(chǎn)生、抑制Αβ的 聚集和加快Αβ的清除等。本發(fā)明從茯磚茶中分離純化，并鑒定出一個(gè)全新結(jié)構(gòu)的黃酮氧 苷類化合物茶山奈苷Β，可同時(shí)抑制Αβ產(chǎn)生和Αβ聚集。
[0056] 茶山奈苷Β按上述制備方法分離純化獲得。具體實(shí)驗(yàn)中的茶山奈苷Β純度為大于 或等于95% ;茶山奈苷Β用水或DMS0溶解后于-20°C保存。
[0057] 本發(fā)明所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)都是通過至少3次獨(dú)立試驗(yàn)獲得，以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差 作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用One-Way AN0VA軟件進(jìn)行，多組比較分析用Duncan's test〇
[0058] 1、茶山奈苷B體外抑制Αβ40和Αβ42產(chǎn)生
[0059] 應(yīng)用Αβ40和Αβ42試劑盒（Invotrigen，USA)，測(cè)定不同濃度茶山奈苷Β對(duì)穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染APP基因的人胚腎細(xì)胞（7PA2,由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)）分泌Αβ40和Αβ42的蛋 白水平影響。
[0060] 1) 7ΡΑ2細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞密度約90%時(shí)，用無血清DME培養(yǎng)基稀釋茶山奈苷Β至不 同濃度（0, 5,10和20μΜ)，添加至細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。
[0061] 2)收集7ΡΑ2細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000rpm離心除去細(xì)胞碎片。
[0062] 3