096] 可進行包被原鑒定的方法有色譜法、紅外光譜法、紫外光譜法、SDS-PAGE凝膠電泳 等。其中最常用的方法是紫外可見光譜法。一般來說，只要包被原的紫外-可見光譜與載 蛋白和半抗原的紫外光譜不同，即可間接說明半抗原成功與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，包被原合成成功。 因為根據(jù)朗伯-比爾定律，當波長一定時，混合物的紫外吸收具有加合性。
[0097] 包被原的紫外光譜表征具體為：將制備的包被原適當稀釋，使其吸光度在0. 1~ 2. 0之間，W PBS為空白對照，用紫外分光光度計在200~500皿分別測定鄰苯二甲酸二甲 醋半抗原和包被原DMP-0VA的吸光值，繪制紫外吸收光譜圖，并根據(jù)W下公式計算偶聯(lián)比：
[0098]
[0099] 式中：孤。。wuggte-偶聯(lián)物吸光度；孤pretem――蛋白質(zhì)吸光值；ODh.pte。――半 抗原吸光值；Chapte。--半抗原濃度；CpfDtei。--蛋白質(zhì)濃度；Mhgpte。--半抗原分子量； Mprotein--蛋白質(zhì)分子量。
[0100] 本發(fā)明采用全波長紫外分光光度計對半抗原、載體蛋白和包被原進行掃描，根據(jù) 特征吸收峰的位置確定偶聯(lián)是否成功。元素分析結(jié)果進一步證明了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和所設計的 路線一致。
[0101] 由紫外光譜（圖4)可知，DMP半抗原在310nm處有特征吸收峰；載體蛋白OVA有 S個紫外吸收峰，分別位于219nm、224nm、268nm處有特征吸收峰，其中268nm紫外吸收峰處 的吸收值較低；包被原DMP-0VA有兩個紫外吸收峰，分別位于231nm和374nm處的紫外光譜 中不僅分別包含OVA的特征峰，還在253nm處出現(xiàn)了新的吸收峰。DMP-0VA半抗原特征吸收 峰發(fā)生了紅移，運可能是受到載體蛋白的吸收峰的影響所致，吸收峰紅移現(xiàn)象的出現(xiàn)說明 偶聯(lián)成功。計算DMP-0VA中DMP與OVA的結(jié)合比分別為43. 9:1。 陽102] (3)鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原蛋白質(zhì)濃度的測定 陽103] 根據(jù)考馬斯亮藍G250法測定包被原蛋白質(zhì)濃度?？捡R斯亮藍G250在游離時為紅 色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后為青藍色，前者最大吸收值在465皿，后者在595皿處。WOVA為標準物 質(zhì)配置不同濃度標準溶液，與一定量考馬斯亮藍G250反應后，分別在595nm處測定溶液吸 光度值。標準溶液在0-150yg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。在稀釋一定倍數(shù)的包被原溶液中 加入考馬斯亮藍染色，在相同波長處測量吸光度值，后與標準曲線比較，得制備的包被原蛋 白質(zhì)濃度為1. 271mg/mL。
[0104] 運些包被原可W作為免疫競爭對象而使用。 W化]連施例6、育接寬爭免巧PCR方法檢測鄰龍二甲酸二甲酯
[0106]為了證明DMP人工包被原DMP-0VA制備成功，通過與DMP標準溶液競爭與抗DMP多克隆抗體之間的特異性識別反應，進而建立直接競爭免疫PCR方法檢測環(huán)境中的DMP， 具體步驟如下：為了增強PCR管的吸附性，用0. 8%的戊二醒對PCR管進行預處理，每孔加 入20yL戊二醒溶液，37°C下溫育5小時，然后用超純水洗涂3次，甩干備用；用包被緩沖 液（0.05MpH9. 60碳酸鹽緩沖液）將人工包被原稀釋至適當濃度，加入到經(jīng)過戊二醒處 理的PCR管中進行包被，每孔20yL4°C下包被過夜；倒掉包被原，每孔加入200yL洗涂液 (0. 01MpH7. 40PBST)進行洗涂，振蕩3分鐘后甩干，洗S遍后加入200yL封閉液（含3% 卵清白蛋白的憐酸鹽緩沖溶液），37°C下溫育1小時；洗板=次，將生物素化抗DMP多克隆 抗體稀釋至適當濃度，每孔加入10yL生物素化抗體及10yLDMP小分子，空白對照孔中加 入20iiLPBS，37°C下溫育30分鐘；洗板S次并甩干，用0.01MpH7.40PBS將親和素稀釋至 適當倍數(shù)，每孔加入20yL37°C下溫育30分鐘；洗板S次并甩干，用0. 01MpH7. 40PBS將 生物素化DNA稀釋至適當倍數(shù)，每孔加入20yL37°C下溫育30分鐘；倒掉溶液后用洗脫液 重復洗涂五次，再用超純水重復洗涂五次；最后加入擴增引物和巧光物質(zhì)，采用20iiL的擴 增體系，每孔加入10yLPCR試劑盒mixture,上下游引物各加入0. 25yL超純水9. 5yL; 在加入PCR擴增試劑時，在巧光PCR反應儀中進行擴增（PCR擴增程序：94°C預變性4min; 94°C20s，55°C20s，72°C20s，W此進行30個循環(huán)；72°C延伸3min)。測定的Ct值與待測抗 原的量成反比。根據(jù)加入已知濃度的抗原和相應的Ct值作標準曲線，從而可W得到相應待 測樣品中鄰苯二甲酸二甲醋的濃度。其測定的擴增曲線與建立的標準曲線如圖5和圖6所 /J、-〇 陽107] 實驗所用到的生物素化DNA(雙鏈DNA詳情如下：
[0108] 5 > -Bio-GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT-3 >
[0109]和'-Bio-AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTC GAATTC-3'）W及相對應的上游引物（5' -GTAAAACGACGGCCAGT-3'）和下游引物 (5' -CAGGAAACAGCTATGAC-3')均由生工生物工程（上海）股份有限公司制備合成。
[0110] 當DMP濃度在lOpg/l-lOOng/L時線性相關(guān)性較好，線性方程為Ct= 0. 33LgCDMP+13. 00(R2= 0. 9846，n= 5)，檢測下限為5. 1化g/L。與傳統(tǒng)儀器分析方法相比， 靈敏度提高了 10000-50000倍。 陽111] W上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，運并不影 響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1. 一種鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原，其結(jié)構(gòu)式如下：2. -種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于， 所述方法包括： 采用戊二醒法，將鄰苯二甲酸二甲醋半抗原 與卵清白蛋 白偶聯(lián)反應，即得所述鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于，所 述偶聯(lián)反應是在O~4°C冰浴遮光條件下進行的，反應時間為24~30h。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于，所 述方法還包括離屯、分離，透析上清液，再次離屯、分離得到所述鄰苯二甲酸二甲醋人工包被 原的步驟。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于，所 述鄰苯二甲酸二甲醋半抗原、戊二醒和卵清白蛋白的摩爾比為1:3~5:0. 005~0. 01。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于，所 述鄰苯二甲酸二甲醋半抗原是通過包括如下步驟的方法制備而得的： 51、 在強酸性介質(zhì)存在的條件下，4-硝基鄰苯二甲酸與甲醇 發(fā)生醋化反應，生成4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋； 52、 在非質(zhì)子性有機溶劑存在的條件下，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋和鋒粉、強酸 發(fā)生還原反應，生成鄰苯二甲酸二甲醋半抗原。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于，步 驟Sl中，4-硝基鄰苯二甲酸、甲醇、強酸性介質(zhì)的摩爾比為1:5~6. 5:0. 5~0. 7,反應溫 度為80~100°C，醋化反應時間為5~6小時；所述強酸性介質(zhì)選自濃鹽酸、濃硫酸或濃硝 酸。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原的制備方法，其特征在于， 步驟S2中，所述4-硝基鄰苯二甲酸二甲醋與強酸、非質(zhì)子性有機溶劑和鋒粉的摩爾比為 1:20~22:550~570:20~22 ;所述還原反應的溫度為25~28°C，還原反應時間為12~ 15小時。9. 一種如權(quán)利要求1所述的鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原在用于痕量塑化劑鄰苯二 甲酸二甲醋檢測中的用途。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述檢測為巧光免疫PCR檢測分析方法， 檢測時所述鄰苯二甲酸二甲醋人工包被原與被分析物鄰苯二甲酸二甲醋直接競爭具特異 性免疫反應的抗鄰苯二甲酸二甲醋特異性抗體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鄰苯二甲酸二甲酯人工包被原制備及其用途；所述人工包被原結(jié)構(gòu)式如下：制備時，4-硝基鄰苯二甲酸與甲醇在強酸的催化作用下酯化反應得鄰苯二甲酸二甲酯半抗原中間體4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯；4-硝基鄰苯二甲酸二甲酯和鋅粉在強酸的作用下發(fā)生還原反應得鄰苯二甲酸二甲酯半抗原；采用戊二醛法，將所述半抗原與卵清白蛋白偶聯(lián)反應，即得包被原DMP-OVA。本發(fā)明的包被原可以與被分析物鄰苯二甲酸二甲酯形成直接競爭關(guān)系，都能特異性識別抗鄰苯二甲酸二甲酯的多克隆抗體，為建立免疫檢測方法奠定基礎(chǔ)。此外，包被原的制備方法簡單，穩(wěn)定性好，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C07C227/04, C07C229/62, C07K14/77, C12Q1/68
【公開號】CN105198985
【申請?zhí)枴緾N201510515135
【發(fā)明人】莊惠生, 孫瑞艷
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年8月20日