1橄攬苦巧及其降解產(chǎn)物
[0027] 圖2標(biāo)準(zhǔn)品的高速逆流色譜圖
[0028] 圖3標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)高速逆流色譜分離后HPLC圖譜
[0029] 圖4徑基酪醇的高速逆流色譜圖
[0030] 圖5徑基酪醇經(jīng)高速逆流色譜分離后的HPLC圖譜 五、【具體實(shí)施方式】
[0031]W下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對(duì)本發(fā)明的限定。
[0032]實(shí)施例I高速逆流色譜標(biāo)準(zhǔn)樣品分離 [003引 1.實(shí)驗(yàn)儀器；
[0034] 化St化rome分析型高速逆流色譜儀（江陰逆流科技有限公司）；分離柱體積： 25ml;值范圍：0. 56~0. 91 ;化ti化romeA半制備型高速逆流色譜儀（江陰逆流科技有限公 司）；螺旋管分離柱（公轉(zhuǎn)半徑：80cm;值范圍：0. 50~0. 80;螺旋管內(nèi)徑：1. 59mm)，單柱體 積180ml，雙柱體積360ml。
[00對(duì) 2.實(shí)驗(yàn)材料：
[0036] 分析純同分異構(gòu)體酪類樣品鄰苯二酪，間苯二酪，對(duì)苯二酪；正己燒、乙酸乙醋、甲 醇、蒸饋水
[0037] 3.配制溶劑與樣品：
[0038] 配制酪類樣品的甲醇混合溶液，混合樣品濃度：鄰苯二酪20mg/ml+間苯二酪 20mg/ml+對(duì)苯二酪lOmg/ml;W80%甲醇溶液為溶劑，分別配制200mg/ml鄰苯二酪溶液、 200mg/ml間苯二酪溶液、和lOOmg/ml對(duì)苯二酪溶液，充分溶解后，各取1ml，加入9ml的 80 %甲醇溶劑，混勻，制成待分離的混合樣品。
[0039] 溶劑體系：正己燒：乙酸乙醋：甲醇：水=3 : 5 : 1 : 5。將300ml正己燒、 500ml乙酸乙醋、100mL甲醇、與500ml蒸饋水充分混合后，分液漏斗分相。
[0040] 4.實(shí)驗(yàn)參數(shù)：
[0041] 鄰苯二酪、間苯二酪、和對(duì)苯二酪的混合物進(jìn)行分離，分離條件為：正己燒-乙酸 乙醋-甲醇-水（3 : 5 : 1 : 5)的溶劑體系；固定相：上相；流動(dòng)相：下相。
[0042] 分析型儀器分離條件：柱體積：34ml;流速：lml/min;室溫：22°C;轉(zhuǎn)速：180化pm; 檢測波長：254皿。進(jìn)樣體積：1ml;進(jìn)樣濃度：鄰苯二酪2mg/ml+間苯二酪2mg/ml+對(duì)苯二 酪Img/ml(混合樣品1:10溶于流動(dòng)相中）
[0043] 制備型儀器分離條件：雙柱分離，柱體積360ml;流速：5ml/min;室溫：22°C;轉(zhuǎn)速： 1200巧m;檢測波長：254nm，進(jìn)樣體積：20ml;樣品濃度：鄰苯二酪2mg/ml+間苯二酪2mg/ ml+對(duì)苯二酪Img/ml(混合樣品1:10溶于流動(dòng)相中）。
[0044] 5.實(shí)驗(yàn)步驟：
[0045] 5. 1.固定相注入：開啟恒流累，W最大流速將固定相通過入口注入分離柱中，充 滿分離柱管路，至出口端流出后，繼續(xù)累1分鐘之后停累。確定有足夠的固定相用于注滿分 離柱（分析柱應(yīng)準(zhǔn)備多于50ml，制備柱應(yīng)多于400ml)，此過程中小屯、不要進(jìn)空氣或者流動(dòng) 相。
[0046] 5. 2.接通外電源，合上儀器后背板左下角的電源開關(guān)，設(shè)置離屯、旋轉(zhuǎn)參數(shù)；設(shè)置 恒流累分離流速（分析型Iml/min，制備型5ml/min)
[0047] 5. 3.系統(tǒng)平衡：確認(rèn)離屯、參數(shù)正確，且分離柱中已經(jīng)注滿液體（固定相）。將恒流 累進(jìn)口的濾器頭插入流動(dòng)相。按照預(yù)設(shè)流速啟動(dòng)恒流累，同時(shí)按下離屯、控制面板上面綠色 的"Run"按鍵，啟動(dòng)離屯、。
[0048] 5. 4.溶劑系統(tǒng)平衡，即出口的流出溶液全部為清澈的流動(dòng)相，或者在線檢測儀信 號(hào)平穩(wěn)后，記錄固定相的排出體積，W計(jì)算固定相保留率；
[0049]Sf=(管路總體積-排出的固定相體積）/分離柱體積*100%
[0050] 本實(shí)驗(yàn)W50ml/min速度累滿固定相，W5ml/min速度累入流動(dòng)相，啟動(dòng) 化ti化rome?A-300正向離屯、，觀察UV3000輸出達(dá)到系統(tǒng)平衡，計(jì)算固定相保留率65%。[005。5. 5.樣品配制：取50mg/ml酪類樣品混合液（鄰苯二酪20mg/ml+間苯二酪20mg/ ml+對(duì)苯二酪lOmg/ml)W1 : 10稀釋于溶劑體系的流動(dòng)相（分析型：0.Iml稀釋于0. 9ml流動(dòng)相；制備型：2ml稀釋于18ml流動(dòng)相），混勻；
[0052] 5. 6.上樣：將相應(yīng)分離柱的上樣閥旋至"loading"位置，將注射器插如連有注射 器接頭的抽樣孔，觀察上樣環(huán)及進(jìn)樣管，推注射器W排出進(jìn)樣管中的空氣，使進(jìn)樣管內(nèi)充滿 從上樣環(huán)中流出的流動(dòng)相。然后將進(jìn)樣管插入配制好的樣品試管（注意插到底部避免進(jìn)氣 泡），抽吸注射器將樣品吸入上樣環(huán)?？蒞將樣品注滿上樣環(huán)，也可W部分充滿上樣環(huán)，但是 注意不能有空氣進(jìn)入上樣環(huán)。然后將上樣閥旋回豎直零位置，樣品將隨累入的流動(dòng)相進(jìn)入 分離柱。
[0053] 5. 7.點(diǎn)擊色譜工作站中的"數(shù)據(jù)采集"，記錄混合樣品的分離曲線。
[0054] 5.8.分離結(jié)束時(shí)，按離屯、控制面板上的"停止"按鍵停止離屯、，并將恒流累停止。 點(diǎn)擊色譜工作站中的"停止采集"鍵，并保存圖譜。
[0055] 5. 9.可W選擇用氮?dú)饣蛘邏嚎s空氣吹出分離柱中所剩的溶液和保留的組分；或 者選擇用固定相將柱內(nèi)溶液W及保留的組分高速推出。
[0056] 5. 10.管路清洗：用恒流累累入約1/3柱體積的甲醇，然后用氮?dú)獯党?；重?fù)S次。 最后一次清洗并吹出甲醇清洗液后，繼續(xù)吹氣的同時(shí)，按下離屯、控制面板上的"轉(zhuǎn)向"鍵，顯 示屏"運(yùn)轉(zhuǎn)"項(xiàng)將顯示"反向離屯、停止"，然后將轉(zhuǎn)速設(shè)為40化pm，啟動(dòng)離心有利于管路中 殘存溶劑的清空。
[0057] 6.分離結(jié)果：
[0058] 鄰苯二酪、對(duì)苯二酪和間苯二酪實(shí)現(xiàn)了良好分離，如圖2和圖3。
[0059] 實(shí)施例2高速逆流色譜和高效液相色譜聯(lián)用方法
[0060] 第一步，徑基酪醇軟膏制備
[0061] 將油橄攬葉橄攬苦巧提取物酶解，提取物與4~7的憐酸鹽緩沖溶液固液比為 Ig: 10~IOOmU提取物與生物酶按質(zhì)量比為Ig: 20~lOOmg，置于30°C~100°C的恒溫 水浴搖床中。酶解Ih~1化后，過濾，濾液經(jīng)乙酸乙醋萃取，乙酸乙醋層濃縮干燥，濃縮物 為徑基酪醇軟膏，軟膏相對(duì)于植物葉子粉末收率1~20%，徑基酪醇含量5~20%;
[0062] 第二步，高速逆流色譜分離
[0063] 1)按體積比選擇石油酸：乙酸乙醋：甲醇：水為3~6: 4~8: 3~6: 4~ 8溶液作為高速逆流萃取溶劑體系，=種溶劑混合充分后靜置，按上下兩相分開，取上相為 固定相，下相為流動(dòng)相，超聲脫氣；
[0064] 2)取徑基酪醇軟膏溶于下相中作為供試樣品，所述徑基酪醇軟膏與下相的質(zhì)量體 積比為Ig: 20血~80血；
[0065] 3)將固定相充滿高速逆流色譜儀的多層線圈分離柱，高速逆流色譜儀分離條件在 500~180化/min轉(zhuǎn)速下，W1~5血/min的流速注入流動(dòng)相，在波長210~280皿的紫外 檢測器檢測，當(dāng)固定相保留率為30%~80%時(shí)，開始供試樣品溶液進(jìn)樣，整個(gè)離屯、過程采 用正相離屯、旋轉(zhuǎn)，時(shí)間為30~300min，用自動(dòng)饋分收集器收集饋出液；
[0066] 第S步，高效液相色譜檢測
[0067]將第二步自動(dòng)饋分收集器收集饋出液，用高效液相色譜進(jìn)行檢測徑基酪醇部位 集分，合并徑基酪醇集分，回收有機(jī)溶劑，濃縮物為黃色徑基酪醇油狀物，徑基酪醇含量 60%~90%。
[0068] 實(shí)施例3高速逆流色譜分離徑基酪醇軟膏實(shí)驗(yàn)
[0069] 1.溶劑準(zhǔn)備：石油酸：乙酸乙醋：甲醇：水=2 : 3 : 2 : 3,按體積比配制 2000ml，W上相為固定相，W下相為流動(dòng)相。
[0070] 2.樣品準(zhǔn)備：取實(shí)施例3中徑基酪醇軟膏50mg，溶于流動(dòng)相50ml。
[007。 3.系統(tǒng)平衡擬50ml/min速度累滿固定化W5ml/min速度累入流動(dòng)相，啟動(dòng)
[0072] 4.化ti化;rome?A-300正向離屯、，觀察UV3000輸出達(dá)到系統(tǒng)平衡，計(jì)算固定相保留 率：60%
[007引 5.上樣：將樣品通過上樣閥注入化ti化rome?A-300中。正向離屯、：將 化ti化rome?A-300設(shè)定為正向離屯、旋轉(zhuǎn)，設(shè)定。樣品經(jīng)檢測器得到圖譜，如附圖4。
[0074] 6.HPLC分析：取圖4第一個(gè)峰吸收最大處時(shí)分離出的液體置于HPLC進(jìn)行檢測，通 過與標(biāo)準(zhǔn)的徑基酪醇樣
[00巧]品的圖譜進(jìn)行對(duì)比，得到分離徑基酪醇圖譜。如附圖5.從圖5的HPLC圖譜可W清晰的看到，化ti化rome?A-300成功的將徑基酪醇分離出來。
[0076] 實(shí)施例4高速逆流色譜制備徑基酪醇軟膏
[0077] 1.徑基酪醇軟膏制備，將低純度橄攬苦巧的橄攬葉提取物加入纖維素酶，提取物 與生物酶按質(zhì)量比為Ig:IOmg,提取物與抑值5的憐酸鹽緩沖溶液固液比為Ig: 30血， 在50°C水解4小時(shí)，過濾，濾液經(jīng)乙酸乙醋萃取，乙酸乙醋層濃縮干燥，濃縮物為徑基酪醇 軟膏，軟膏相對(duì)于植物葉子粉末收率4. 7%，徑基酪醇含量8. 3% ;