一種新的二萜化合物及其醫(yī)藥用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從車前草中分離得到的一種新的二萜化合 物，含其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 車前草為車前科Plantaginaceae植物車前PlantagoasiaticaL?或平車前 PlantagodepressaWilld?的干燥全草，是《中國藥典》（2010年版）收載的常用中藥。目 前，已發(fā)現(xiàn)的車前科有3屬，約200種，分布遍及全世界。我國僅產(chǎn)車前屬Plantago,約13 種。除車前與平車前外，國內(nèi)外研究較多車前草還有大車前PlantagomajorL.。車前草 性味甘寒，具有利水、清熱、明目、祛痰的功效。主治淋病、尿血、小便不通、黃疽、水腫、熱痢、 泄瀉、目赤腫痛、喉痛等。《草性論》載"治尿血，能補(bǔ)五臟，明目，利小曬干的車前草便，通五 淋"?！侗静莘暝份d"若虛滑精氣不固者禁用"。性味和功用甘，寒，歸手太陽，陽明經(jīng)。利 7K，清熱，明目，祛痰，用于小便不通，淋池，帶下，尿血，黃疸，水腫，熱痢泄瀉，鼻紐，目赤腫 痛，喉痛，咳嗽，皮膚潰瘍。
[0003] 訖今為止，已從前述3種車前草中分離和鑒定出超過60種化合物，按其主要結(jié)構(gòu) 類型可分為環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯乙基苷類、酚酸類和脂肪酸類等成分。環(huán)烯醚萜類有利 尿，抑菌，抗四氧化碳引起的肝中毒，利膽作用；黃酮類可作用于呼吸中樞，緩解呼吸運(yùn)動(dòng)而 鎮(zhèn)咳，興奮分泌神經(jīng)使氣管及支氣管分泌增加而祛痰；苯乙基苷類有消炎、抑菌、抑制Camp 磷酸二酯酶和醛糖還原酶的活性；酚酸類具有殺菌、升白、利膽、抑制血小板聚集等功能。
[0004] 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，車前草具有多種藥理活性，用途廣泛，可以用于治療慢性支 氣管炎、急性黃疸型肝炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、高血壓、細(xì)菌性痢疾、隱匿性腎炎、青光眼和痛風(fēng) 等。
[0005]PC12細(xì)胞株源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，具有神經(jīng)元的特征，因此作為神經(jīng)元的模型用 于研究神經(jīng)元細(xì)胞的死亡方式及機(jī)制的研究。多項(xiàng)研究已經(jīng)表明，AP對(duì)PC12細(xì)胞的細(xì)胞 毒性作用是由于氧應(yīng)激、線粒體功能異常等引致細(xì)胞凋亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從車前干燥全草中分離得到的一種新的二萜化合物，含 其的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)車前草粉碎，用80%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃 取物用大孔樹脂除雜，依次用20%乙醇和80%乙醇洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮 得80%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟（b)中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積 比為90:1、60:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c) 中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為65 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-11個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到 純的化合物（I)。
[0011] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] 藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0013] 所述的化合物（I)在制備保護(hù)神經(jīng)的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備保護(hù)神經(jīng)的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、 對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0018] 說明書附圖
[0019] 圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0020] 圖2為化合物（I)二維HSQC譜；
[0021 ] 圖3為MTT代謝率檢測A0 25 35對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用；
[0022] 圖4為A0 25 35對(duì)PC12細(xì)胞LDH釋放率的影響；
[0023] 圖5為A0 25 35和/或化合物（I)對(duì)PC12細(xì)胞LDH釋放率的影口向。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0025] 主要材料、試劑來源：
[0026] 乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限 公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0027]A0 25 35購于美國sigma公司。MTT(四唑氮藍(lán)）購于美國Amresco公司。LDH測定 試劑盒購于南京建成生物有限公司。吖啶橙（A0)購于美國sigma公司。溴化乙啶（EB)購 于美國sigma公司。RNase酶購于美國sigma公司。蛋白酶K購于美國sigmaAnnexin公 司。V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。D-MEM/F12培養(yǎng) 基干粉購于美國GibcoL公司。馬血清購于美國hycLon公司。胎牛血清購于杭州四季青生 物工程有限公司。多聚賴氨酸（PLL)購于美國sigma公司。
[0028] 儀器類型：低溫高速離心機(jī)，美國Heraeus;二氧化碳培養(yǎng)箱，美國SHELL/JB;超 凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；雷勃MK3酶標(biāo)儀，芬蘭Thermolabsystems;焚光顯微鏡，德國 Leica;流式細(xì)胞儀EpicsXL，美國CouLter公司；電泳系統(tǒng)，北京六一儀器廠；雷勃MK3酶標(biāo) 儀，芬蘭Thermolabsystems;焚光顯微鏡，德國Leica;流式細(xì)胞儀EpicsXL，美國CouLter 公司；電泳系統(tǒng)，北京六一儀器廠。
[0029] 實(shí)施例1:化合物（I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0030] (a)車前的干燥全草（8kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提?。?5LX3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（6L)，依次用石油醚（6LX3次）、乙酸乙酯（6LX3次）和水飽和的正丁 醇（6LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（333g)和正丁醇萃取物；(b) 步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，依次用20%乙醇（8L)和80% (12L) 乙醇洗脫，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物浸膏（152g) ;(c)步驟（b) 中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1 (7個(gè)柱體積）、60:1 (7個(gè)柱體 積）、30:1(8個(gè)柱體積）、15:1(7個(gè)柱體積）和1:1 (5個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4 (38g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為 20:1 (10個(gè)柱體積）、12:1 (8個(gè)柱體積）和5:1 (6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得 到3個(gè)組分；（e)步驟（d)中組分2 (llg)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為65 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-11個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純 的化合物（I) (26mg)。
[0031] 結(jié)構(gòu)確證：
[0032] 白色針狀結(jié)晶，易溶于丙酮和甲醇；HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z431. 2002,結(jié) 合核磁特征可得分子式為C22H3207，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)SH(PPm，DMS0-d6， 400MHz) :H-1 (1. 77,ddd，J= 13. 0, 3. 8,2. 6)，H-l(1. 53,ddd，J= 13. 5,13. 0,3. 7)， H-2(2. 01，m)，H-2(1. 67，dddd，J= 15. 0,3. 5,3. 3,3. 2)，H-3(4. 69,t，J= 2. 7)，H-5(1. 39， dd，J= 9. 8,1. 8)，H-6 (1. 75,ddd，J= 12. 7,12. 2,9. 8)，H-6 (1. 86,ddd，J= 12. 7, 5. 3， 1.8)，H-7(4.39，dd，J= 12.2,5.3)，H-9(1.41，d，J= 4.2)，H-11(3. 10，dd，J= 4.2,4. 1)， H-12 (3. 14,dd，J= 3. 8, 3. 8)，H-13 (3. 39,dd，J= 3. 8,1. 3)，H-14 (5. 04,d，J= 1. 3)， H-17 (6. 11，s)，H-17 (5. 56,s)，H-18 (0? 94,s)，H-19 (1. 01，s)，H-20 (1. 40,s)，3-0Ac(2. 80， s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc (ppm，DMS0-d6,100Hz) :34. 0 (CH2,1-C)，23. 5 (CH2, 2-C)，79. 0 (CH， 3-C)，37. 5 (C，4-C)，48. 1 (CH，5-C)，29. 9 (CH2, 6-C)，75. 5 (CH，7-C)，58. 8 (C，8-C)，53. 3 (CH， 9-C)，41. 8(C，10-C)，50. 9(CH，11-C)，55. 6(CH，12-C)，49. 2(CH，13-C)，73. 7(CH，14-C)， 208. 9(C，15-C)，145. 7(C，16-C)，119. 1 (CH2,17-C)，28. 7(CH3, 18-C)，22. 8(CH3,19-C)， 16.8(CH3,20-C)