算：
[0019]
[0020]
[0021] 本發(fā)明的目的之二是，一種用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法， 其特征在于：它包括以下內(nèi)容：
[0022] 1)選擇菌株：選擇惡臭假單胞菌和乙酸鈣不動桿菌，惡臭假單胞菌和乙酸鈣 不動桿菌均來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，糞產(chǎn)堿菌的菌株編號為CGMCC No.1. 1003,乙酸鈣不動桿菌的菌株編號為CGMCCNo.1. 3615,將惡臭假單胞菌的菌株簡稱 為BA1、乙酸鈣不動桿菌的菌株簡稱為BA2 ;
[0023] 2)菌株的活化：從營養(yǎng)肉汁瓊脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分別接種于100mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h進行菌株的活化；
[0024] 3)菌株的馴化：取活化后的BA1和BA2培養(yǎng)液各10mL，分別接種于含有苯胺的馴 化培養(yǎng)基中，置于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，進行菌株的馴化，培養(yǎng)36h后再重復(fù)上述 過程進行第二個周期的馴化，共馴化5個周期，180h，前兩個馴化周期加入1. 5mL經(jīng)過濾除 菌的10% (w/v)苯胺溶液，第三個周期加入3.OmL經(jīng)過濾除菌的10% (w/v)苯胺溶液，最 后兩個馴化周期加入8mL經(jīng)過濾除菌的10% (w/v)苯胺溶液；
[0025] 4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單 菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，待菌苔長出后放入4°C冰箱中低溫保存?zhèn)溆茫?br>[0026] 5)菌落形態(tài)觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培 養(yǎng)基中，置于30°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)，主要通過菌落的顏色、透明 度、表面光滑性和邊緣形態(tài)對用于苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建的BA1和BA2菌株進 行區(qū)分；
[0027] 6)菌懸液制備：將馴化后的BA1和BA2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中， 置于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液置于臺式高速冷凍離心機中以lOOOOrpm 離心5min后，棄去上清液后用0.lmol/L,pH8. 0的Na2HP04_NaH2P04緩沖液重懸，再次離心后 棄去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.lmol/L，pH8. 0的Na2HP04_NaH2P04緩沖溶液重 懸，分別制成〇D_= 1. 2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時通過平板計數(shù)法分別測定菌 懸液中BA1和BA2的活菌數(shù)；
[0028] 7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌懸液的制備：根據(jù)菌懸液中測定的BA1和BA2 活菌數(shù)，吸取BA1和BA2的菌懸液，使混合后的BA1、BA2菌懸液的總活菌量為2X10SCFU/ mL，并使BA1 和BA2 活菌初始比例分別為 0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1 和 10/0,其中10/0代表體系中僅有BA1，0/10代表體系中僅有BA2 ;
[0029] 8)二元復(fù)合菌群最佳配比的選擇：將BA1和BA2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、 3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液分別以10%&八）的量分別接種于 含苯胺300mg/L的無機鹽培養(yǎng)液中，于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)36h后測定殘留的苯 胺和T0C濃度，同時通過倍比稀釋法依據(jù)菌落形態(tài)特征對生物降解反應(yīng)結(jié)束后體系中BA1 和BA2的數(shù)量進行計量；定義CFUBA1為BA1在10/0體系中的活菌數(shù)，即僅接種BA1的體系， CFUBA2為BA2在0/10體系中的活菌數(shù)，即僅接種BA2的體系，CFUBA1 .BA2為BA1在BA2存在時的 活菌數(shù)，CFUBA2.BA1為BA2在BA1存在時的活菌數(shù)，BA1的相對活菌數(shù)
PR2的相對活菌I
當(dāng)RCFU< 1時，代表一株菌生長和繁殖受到了另 一株菌的抑制，而當(dāng)RCFU> 1時，代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進 作用；根據(jù)兩株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、T0C降解率以及RCFU計算結(jié)果，選 擇苯胺降解率、T0C降解率最高且RCFUBA1和RCFUBA2計算結(jié)果均大于1的初始活菌比例作為 苯胺生物降解二元復(fù)合菌群的構(gòu)建比例，此時二元復(fù)合菌群對苯胺的降解效果最佳且形成 了互利共生的關(guān)系。
[0030] 所述的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的組分為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾 水1000mL，pH7. 0,121°C滅菌20min后備用，制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時加入20g瓊 脂。
[0031] 所述的馴化液體培養(yǎng)基的組分為（NH4)2S043g，KH2P040 . 5g，NaHP040 . 5g，MgS04 ? 7H200. 3g，微量元素液lmL，蒸餾水1000mL，pH7. 5,121°C滅菌20min，待冷卻后加入 經(jīng)過濾除菌的10% (w/v)苯胺溶液。
[0032]所述的微量元素液的組分為FeS04?7H20 0? 5g，MnS04?H20 0? 15g，ZnS040. 14g，
[0034] Cocl20. 2g，蒸饋水lOOOmL。[0033] 所述的苯胺降解率及TOC降解率采用以下公式進行計算：
[0035]
[0036] 將本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，結(jié)果如下：
[0037] 中國專利申請?zhí)?01110287122.X，名稱為一種用于降解城市廢水的優(yōu)勢菌群及 其制備方法，公開了制備構(gòu)成優(yōu)勢菌群的陰溝腸桿菌（Enterobactercloacae)、戈登氏菌 (Gordonia)和惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)體積百分比分別是20~24%、54~ 58%和26~18%，然而并未明確指出獲得該體積百分的具體方法。而本發(fā)明通過測定不同 比例的兩株菌投加到待處理廢水中后對目標污染物的濃度及活菌數(shù)量，綜合考察污染物處 理效果和微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而獲得二元復(fù)合菌群的精確配比；
[0038] 中國專利申請?zhí)?00710064363. 1，名稱為一種降解酚類有機物的方法及其專用菌 群，公開了一種采用含有發(fā)孢甲基彎曲菌的混合菌群MY9CGMCCNo. 1893在溫和條件下高 效降解酚類有機物的方法，然而并未給出混合菌群的具體群落結(jié)構(gòu)組成及所涉及微生物的 相對比例，而本發(fā)明是在獲得具體菌株并了解其污染物降解特性的基礎(chǔ)上，通過簡便而快 速的構(gòu)建方法，綜合二元復(fù)合菌群的污染物降解效果和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，給出菌株的確切 配比；
[0039] 中國專利申請?zhí)?00810063737. 2,名稱為降解"三苯"VOCs廢氣的復(fù)合微生物菌 劑的制備方法，公開了的用于"三苯"V0CS廢氣降解的復(fù)合微生物菌劑是以含目標污染物的 培養(yǎng)基馴化活性污泥的方法獲得的，馴化周期長，且該發(fā)明并未對經(jīng)干燥后碾磨成粉末狀 的復(fù)合微生物菌劑發(fā)酵物經(jīng)長期保存后的污染物效果進行驗證，由于群落結(jié)構(gòu)未知，該復(fù) 合菌群的規(guī)?；a(chǎn)及應(yīng)用效果難以得到保證，而本發(fā)明是在分離純化高效降解菌株的基 礎(chǔ)上，采用復(fù)合菌群的構(gòu)建方法，對復(fù)合菌群的配比進行優(yōu)化，其穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)組成能夠 保證其高效穩(wěn)定的污染物降解效果，且在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，其種子液的發(fā)酵過程可分別進 行，以獲得活性高的初始菌株，為復(fù)合菌群的構(gòu)建奠定了必要的基礎(chǔ)；
[0040] 中國專利申請?zhí)?01110128285. 3,名稱為一種降解多環(huán)芳烴的混合菌劑，公開了 混合菌劑的具體組成，然而并未涉及混合菌劑中不同微生物在種子液中的相對比例和投加 到待處理廢水中后其相對數(shù)量的變化規(guī)律，由于不同污染場地中污染物的濃度及環(huán)境條件 存在著不同程度的差異，因而該混合菌劑的針對性和實用性有待考證，而本發(fā)明直接以含 有目標難降解有機污染物的待處理廢水為環(huán)境介質(zhì)，通過污染物降解效果及群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 性的考察，能獲得針對性強、污染物降解效果好和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二元復(fù)合菌群，因而能保 證良好的實地應(yīng)用效果；
[0041] 中國專利申請?zhí)?013105523877,名稱為一種用于降解造紙廢水的復(fù)合菌群及其 制備方法，公開了構(gòu)成降解造紙廢水復(fù)合菌群的土壤桿菌、桿狀菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單 胞菌和施氏假單胞菌的體積百分比分別為5-8 %、2-5 %、10-15 %、26-41 %和34-56 %，但 是并未給出獲得該體積比的依據(jù)，同時由于各菌株培養(yǎng)營養(yǎng)條件不同，其對數(shù)增長期培養(yǎng) 液中各菌株的相對數(shù)量也有所不同，以體積比作為定量化依據(jù)降低了該復(fù)合菌群在實際生 產(chǎn)中的可操作性。而本發(fā)明中涉及了兩種獨立的高效菌株，在實際操作中，可以采用測定殘 余目標污染物濃度和RCFU的方法，對降解效果和菌株在待處理污染中的存在狀態(tài)進行系 統(tǒng)的把握，從而能構(gòu)建出配比明確、降解效果好和群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二元復(fù)合菌群；
[0042] 本發(fā)明的用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法和用于廢水中苯胺 生物降解的二元復(fù)合菌群的構(gòu)建