一種用于廢水中生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于廢水生物處理領(lǐng)域，是一種用于廢水中生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著化學(xué)工業(yè)的飛速發(fā)展，新技術(shù)和新材料的開發(fā)與應(yīng)用使得廢水中含 有大量的有機污染物。由于這些物質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和生物陌生性，污染環(huán)境中能降解 轉(zhuǎn)化該類污染物的土著微生物種類和數(shù)量較少，甚至沒有能降解某些特殊污染物的土著微 生物，因此，傳統(tǒng)的廢水生化處理工藝很難將其有效的去除，這些難降解有機污染物將隨廢 水處理系統(tǒng)外排水或生物固體廢棄物以第二污染源的形式最終反饋到水體、土壤及大氣 中，對人類及其他生命體的健康和生態(tài)環(huán)境都將構(gòu)成嚴重威脅。此外，城市化進程使得城市 用地逐年緊張，傳統(tǒng)污水處理工藝流程長、占地面積大、操作復(fù)雜等矛盾也日趨突出，提標(biāo) 和提效改造成為城市污水處理廠在現(xiàn)有基礎(chǔ)上節(jié)能降耗和更好發(fā)揮其污染治理效果的必 經(jīng)途徑。
[0003] 大量研究表明，通過向生化處理系統(tǒng)中投加復(fù)合菌群的生物增強技術(shù)可以最大限 度發(fā)揮微生物的潛力，有效解決傳統(tǒng)生化處理工藝難降解有機污染物去除效率低、運行效 果不穩(wěn)定等突出問題。復(fù)合菌群又稱復(fù)合菌劑、復(fù)合微生物、混合菌劑等，是基于微生態(tài)學(xué) 理論，利用微生物菌群的聯(lián)合作用，由兩種或兩種上的微生物共同培養(yǎng)、相互作用、相互影 響，最終達到發(fā)揮其最大群體優(yōu)勢的微生態(tài)系統(tǒng)。在污染環(huán)境中，單一菌株往往不能完成或 只能對有機物的降解起很微弱的作用，而復(fù)合菌群可以利用多種微生物的共生互利關(guān)系， 通過多步轉(zhuǎn)化將復(fù)雜的有機物協(xié)同代謝為對環(huán)境無害的終產(chǎn)物。復(fù)合菌群的出現(xiàn)是人類對 于微生物認識的自然結(jié)果，很多生化反應(yīng)過程是單一微生物不能完成或只能微弱進行的， 而在兩種或多種微生物共存的條件下，微生物之間的共生、共養(yǎng)和共榮等使得生化反應(yīng)過 程朝著出現(xiàn)有益效果的方向發(fā)展。隨著純培養(yǎng)技術(shù)的完善和對微生物間互生和共生現(xiàn)象的 研究，人為的微生物混合培養(yǎng)或混合發(fā)酵日益?zhèn)涫苤匾暎纱水a(chǎn)生了結(jié)構(gòu)和功能多樣的復(fù) 合菌群。
[0004] 復(fù)合菌群的構(gòu)建原理是將不同的微生物菌株針對不同的處理體系進行科學(xué)組合， 構(gòu)建出高效的或具有特定功能的菌群。其構(gòu)建過程首先是對微生物進行優(yōu)選、馴化，將具有 不同功能的菌群提取出來，然后針對各類工業(yè)廢水、天然水體和市政污水等不同處理對象、 環(huán)境，經(jīng)多次組合搭配，構(gòu)建出最優(yōu)組合的復(fù)合菌群。處理對象和應(yīng)用場合的不同使目前 復(fù)合菌群的開發(fā)呈多樣化的發(fā)展趨勢。目前，我國環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域?qū)?fù)合菌群的研究主要集 中于兩大類：一類是對現(xiàn)有以日本比嘉照夫教授研制的有效微生物菌群（HighEffective ComplexMicroorganisms，簡稱EM)為代表的商品化復(fù)合菌劑進行研究和應(yīng)用，另一類是 根據(jù)所應(yīng)用的環(huán)境條件和所達的目的，利用篩選到的微生物配置、優(yōu)化的微生物制劑。商品 化的復(fù)合菌群細菌種類和配比固定，難以適應(yīng)生產(chǎn)實踐中含有多種污染物的廢水處理的需 要；此外，利用篩選到的菌株進行復(fù)合菌群的構(gòu)建時往往要經(jīng)過較長周期的馴化和反復(fù)的 配比實驗以獲得菌株復(fù)合的最佳比例，且實驗室條件下確定的最佳比例投加到實際污染場 地后能否長期維持穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)并形成良好的互利共生關(guān)系很難預(yù)知。因此，開發(fā)簡單、 快速和有效的復(fù)合菌群構(gòu)建方法是將其更好地規(guī)?；瘧?yīng)用到廢水中所含有機污染物的生 物分解和轉(zhuǎn)化過程中亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是，為強化微生物對廢水中苯酚和苯胺的分解和轉(zhuǎn)化，而提供科學(xué) 合理，便于實施，配比明確，降解效果好，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，用于廢水中苯酚生物降解的二元復(fù) 合菌群的構(gòu)建方法和用于廢水中苯胺生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明的目的之一是由以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種用于廢水中苯酚生物降解的 二元復(fù)合菌群構(gòu)建方法，其特征在于，它包括以下內(nèi)容：
[0007] 1)選擇菌株：選擇糞產(chǎn)堿菌和乙酸鈣不動桿菌，糞產(chǎn)堿菌和乙酸鈣不動桿菌均來 源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，糞產(chǎn)堿菌的菌株編號為CGMCCNo. 1. 2098,乙酸鈣 不動桿菌的菌株編號為CGMCCNo. 1. 6186,將糞產(chǎn)堿菌的菌株簡稱為PR1、乙酸鈣不動桿菌 的菌株簡稱為PR2 ;
[0008] 2)菌株的活化：從營養(yǎng)肉汁瓊脂斜面上挑取PR1和PR2的菌苔分別接種于100mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，置于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h進行菌株的活化；
[0009] 3)菌株的馴化：取活化后的PR1和PR2培養(yǎng)液各10mL，分別接種于含有苯酚的馴 化培養(yǎng)基中，置于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，進行菌株的馴化，培養(yǎng)24h后再重復(fù)上述 過程進行第二個周期的馴化，共馴化5個周期，120h，前兩個馴化周期加入1. 5mL經(jīng)過濾除 菌的10% (w/v)苯酚溶液，第三個周期加入3.OmL經(jīng)過濾除菌的10% (w/v)苯酚溶液，最 后兩個馴化周期加入8mL經(jīng)過濾除菌的10% (w/v)苯酚溶液；
[0010] 4)菌株的保存：將馴化后的菌株采用倍比稀釋法在平板上得到單菌落后，挑取單 菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，待菌苔長出后放入4°C冰箱中低溫保存?zhèn)溆茫?br>[0011] 5)菌落形態(tài)觀察：采用平板劃線的方法將菌株分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培 養(yǎng)基中，置于30°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)，主要通過菌落的顏色、透明 度、表面光滑性和邊緣形態(tài)對用于苯酚生物降解的二元復(fù)合菌群構(gòu)建的PR1和PR2菌株進 行區(qū)分；
[0012] 6)菌懸液制備：將馴化后的PR1和PR2分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中， 置于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液置于臺式高速冷凍離心機中以lOOOOrpm 離心5min后，棄去上清液后用0.lmol/L,pH8. 0的Na2HP04_NaH2P04緩沖液重懸，再次離心后 棄去上清液，如此操作兩次清洗菌體，再用0.lmol/L，pH8. 0的Na2HP04_NaH2P04緩沖溶液重 懸，分別制成〇D_=1. 2的菌懸液置于冰箱中冷藏備用，同時通過平板計數(shù)法分別測定菌 懸液中PR1和PR2的活菌數(shù)；
[0013] 7)不同PR1、PR2初始配比的混合菌懸液的制備：根據(jù)菌懸液中測定的PR1和PR2 活菌數(shù)，吸取PR1和PR2的菌懸液，使混合后的PR1、PR2菌懸液的總活菌量為2X10SCFU/ mL，并使PR1 和PR2 活菌初始比例分別為 0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1 和 10/0,其中10/0代表體系中僅有PR1，0/10代表體系中僅有PR2 ;
[0014] 8)二元復(fù)合菌群最佳配比的選擇：將PR1和PR2活菌初始比例為0/10、1/9、2/8、 3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌懸液以10%&八）的量分別接種于含有 200mg/L苯酸的無機鹽培養(yǎng)液中，于30°C，150rpm搖床中振蕩培養(yǎng)12h后測定殘留的苯酸和 TOC濃度，同時通過倍比稀釋法依據(jù)菌落形態(tài)特征對生物降解反應(yīng)結(jié)束后體系中PR1和PR2 的數(shù)量進行計量；定義CFUPR1為PR1在10/0體系中的活菌數(shù)，即僅接種PR1的體系，CFUPR2 為PR2在0/10體系中的活菌數(shù)，即僅接種PR2的體系，CFUPR1 .PR2為PR1在PR2存在時的活 菌數(shù)，CFUPR2.PR1為PR2在PR1存在時的活菌數(shù)，PR1的相對活菌數(shù)
PR2的相對活菌
，當(dāng)RCFU< 1時，代表一株菌生長和繁殖受到了另 一株菌的抑制，而當(dāng)RCFU> 1時，代表另一株菌的存在對該菌株的生長和繁殖起到了促進 作用；根據(jù)兩株菌在不同初始活菌比例下的苯酚降解率、TOC降解率以及RCFU計算結(jié)果，選 擇苯酚降解率、TOC降解率最高且RCFUPR1和RCFUPR2計算結(jié)果均大于1的初始活菌比例作為 苯酚生物降解二元復(fù)合菌群的構(gòu)建比例，此時二元復(fù)合菌群對苯酚的降解效果最佳且形成 了互利共生的關(guān)系。
[0015] 所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的組分為牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸餾水 1000mL，pH7. 0,121°C滅菌20min后備用，制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基時加入20g瓊脂。
[0016]所述的馴化培養(yǎng)基的組分為（NH4)2S043g，KH2P040 . 5g，NaHP040 . 5g，MgS04?7H20 〇. 3g，微量元素液lmL，蒸餾水1000mL，pH 7. 5,121°C滅菌20min，待冷卻后加入經(jīng)過濾除菌 的10% (w/v)苯酚溶液。
[0017]所述的微量元素液的組分為FeS04 ? 7H20 0? 5g，MnS04 ?H20 0? 15g，ZnS040. 14g， C〇C120. 2g，蒸餾水 1000mL。
[0018] 所述的苯酚降解率及TOC降解率采用以下公式進行計