一株楊樹根際解磷細(xì)菌Pseudomonas frederiksbergensis JW-SD2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株楊樹根際解磷細(xì)菌Pseudomonas frederiksbergensisJW-SD2 及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 楊樹是中國(guó)最主要的造林樹種之一，全國(guó)楊樹林面積達(dá)700萬(wàn)公頃。磷是植物生 長(zhǎng)發(fā)育所必須的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，但由于磷在土壤中往往以不溶性的磷化合物存在，不 能供給植物直接吸收利用，成為了制約植物生長(zhǎng)的限制性營(yíng)養(yǎng)元素。楊樹人工林多采用短 期輪伐的經(jīng)營(yíng)方式，頻繁的收獲進(jìn)一步造成了楊樹林地磷元素的缺乏和地力衰退。土壤缺 磷已經(jīng)成為了影響楊樹生長(zhǎng)，阻礙楊樹產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸問題。農(nóng)林業(yè)上采用施用磷 肥來增加土壤肥力，但由于可溶性的磷酸根離子和土壤金屬離子的迅速螯合，使得磷肥的 使用效率極低。加之磷肥的高額成本及施用過程存在破壞生態(tài)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)，開發(fā)和利用新 型的磷肥替代產(chǎn)品成為了農(nóng)林業(yè)發(fā)展迫切的要求。因此，以解磷細(xì)菌為代表的生物菌肥開 發(fā)和利用受到了人們的關(guān)注。
[0003] 解磷細(xì)菌是一類能夠溶解不溶性磷化合物，增加土壤肥力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)的土壤 細(xì)菌。解磷細(xì)菌在植物根際土壤中分布廣泛，目前解磷細(xì)菌的開發(fā)和研究工作主要集中在 農(nóng)業(yè)上，而關(guān)于解磷細(xì)菌在林木根際的篩選和應(yīng)用研究相對(duì)較少。不同的解磷細(xì)菌所具有 的解磷能力也有所不同，分離高效的解磷細(xì)菌，挖掘土壤磷庫(kù)資源，是解磷細(xì)菌研究的基 礎(chǔ)。此外，弄清楚解磷細(xì)菌的解磷特性，研究其植物促生能力將為其開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 而這些研究也將進(jìn)一步為我國(guó)林業(yè)生產(chǎn)中急需解決土壤缺磷問題提供新的解決路徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明的目的在于提供一株楊樹 根際解磷細(xì)菌P.frederiksbergensisJW-SD2,其具有較強(qiáng)的解磷能力，并能在復(fù)雜 的環(huán)境條件下發(fā)揮其解磷能力。本發(fā)明的另一目的是提供上述的楊樹根際解磷細(xì)菌 P.frederiksbergensisJW-SD2在促進(jìn)楊樹苗木生長(zhǎng)上的應(yīng)用。
[0005] 技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] 一株楊樹根際解磷細(xì)菌，其分類命名為Pseudomonasfrederiksbergensis JW-SD2,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)：CCTCCM2015350,保藏日期為： 2015年6月2日，保藏地址為：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0007] 所述的楊樹根際解磷細(xì)菌P.frederiksbergensisJW-SD2在溶解難溶性無機(jī)磷酸 鹽中的應(yīng)用。
[0008] 所述的難溶性無機(jī)磷酸鹽為磷酸鈣。
[0009] 所述的環(huán)境條件因素包括溫度，酸堿度，溶氧條件，鹽離子濃度。
[0010] 所述的楊樹根際解磷細(xì)菌P.frederiksbergensisJW-SD2在促進(jìn)楊樹苗木生長(zhǎng)中 的應(yīng)用。
[0011] 解磷細(xì)菌P. frederiksbergensis JW-SD2分離自山東沂水楊樹根際土壤（棕壤 土）。
[0012] JW-SD2的生物學(xué)特征：JW-SD2菌株接種于LB培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3天后，菌落圓形， 黃色不透明，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)光滑（圖1，A);顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株為棒狀或短桿狀， 具有一端生的一根或兩根鞭毛（圖1，B);該菌株為好氧性細(xì)菌（圖1，C)。JW-SD2菌株接 種于NBRIP培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5天，菌落圓形，黃色不透明，菌落中心薄而邊緣厚，菌落外圍 有明顯的溶磷透明圈，直徑為菌落直徑的3倍（圖2)。
[0013]JW-SD2 菌株 16SrDNA序列，見SEQIDNO. 1 所示。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST序列 比對(duì)結(jié)果顯不，該JW-SD2 與Pseudomonasfrederiksbergensis(KC934887. 1)具有 99% 的相似度。Biolog檢定系統(tǒng)鑒定結(jié)果也表明JW-SD2為一株P(guān)seudomonas菌株。結(jié)合形 態(tài)特征、Biolog檢定系統(tǒng)鑒定和16SrDNA序列分析，JW-SD2菌株被鑒定為Pseudomonas frederiksbergensisJW-SD2。
[0014] 上述的楊樹根際解磷細(xì)菌P. frederiksbergensis JW-SD2對(duì)難溶性磷酸鹽有較 強(qiáng)的溶解能力，能夠在較為復(fù)雜的環(huán)境條件下發(fā)揮其解磷能力。接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種 JW-SD2菌株的NL895楊樹苗高、地徑生長(zhǎng)均顯著強(qiáng)于對(duì)照處理，說明該JW-SD2菌株對(duì)楊樹 苗木具有較好的促生作用。
[0015] 所述的楊樹根際解磷細(xì)菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法：將 P.frederiksbergensisJW-SD2菌株在LB培養(yǎng)基活化，30°C，180r/min培養(yǎng)至菌體濃度為 10scfu?mL\取lmL發(fā)酵液5000Xg離心5min，收集菌體，無菌生理鹽水洗滌2次，將菌體 重新懸浮于lmL滅菌生理鹽水中，制備成種子液；按1 %接種量將JW-SD2菌種子液接入含 磷的NBRIP培養(yǎng)基，20-35°C，pH4-10,并向NBRIP培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比濃度0% -3. 0% 的NaCl，180r?min1進(jìn)行震蕩培養(yǎng)解磷48-96h。
[0016] 所述的楊樹根際解磷細(xì)菌P.frederiksbergensisJW-SD2的解磷方法，優(yōu)選： 30°C，pH7,加入 1. 0%NaCl，180r?min1 進(jìn)行震蕩培養(yǎng)解磷 72h。
[0017] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的楊樹根際解磷細(xì)菌P.frederiksbergensis JW-SD2的優(yōu)勢(shì)包括：對(duì)難溶性的無機(jī)磷酸鹽磷酸三鈣（Ca3(P04)2)具有較強(qiáng)的溶解能力； 能夠在較大變化幅度的溫度、酸堿度、溶氧條件、鹽離子濃度條件下發(fā)揮其解磷能力；通過 盆栽楊樹苗的接種試驗(yàn)，證明JW-SD2菌株能夠顯著的促進(jìn)楊樹苗的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明的 P.frederiksbergensisJW-SD2能為開發(fā)微生物菌肥提供優(yōu)良的菌株資源，具有良好的應(yīng) 用開發(fā)潛力和前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1是JW-SD2菌株的生物形態(tài)學(xué)特征圖；其中，A圖為JW-SD2菌株接種于LB培 養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)3天后示意圖，B圖是顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)圖，C圖為好氧性細(xì)菌圖；
[0019] 圖2是JW-SD2菌株在NBRIP培養(yǎng)基上的解磷情況結(jié)果圖；
[0020] 圖3是JW-SD2菌株在NBRIP液體培養(yǎng)基中解磷動(dòng)力學(xué)結(jié)果圖；
[0021 ] 圖4是JW-SD2菌株在NBRIP液體培養(yǎng)基中的pH及可滴定酸度結(jié)果圖；
[0022] 圖5是JW-SD2菌株在不同溫度條件下的解磷能力結(jié)果圖；
[0023] 圖6是JW-SD2菌株在不同初始pH下的解磷能力結(jié)果圖；
[0024] 圖7是JW-SD2菌株在不同裝液量下的解磷能力結(jié)果圖；
[0025] 圖8是JW-SD2菌株在不同NaCl濃度下的解磷能力結(jié)果圖；
[0026] 圖9是JW-SD2菌株對(duì)NL895楊樹苗（Populuseuramericanacv.)生長(zhǎng)影響的結(jié) 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。根據(jù)下述實(shí)施例，可以使本領(lǐng)域 的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制 權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0028] 以下實(shí)例中，LB培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾 水1000mL，pH 7. 0,固體培養(yǎng)基添加1. 5g/100mL的瓊脂。磷酸鹽生長(zhǎng)培養(yǎng)基（NBRIP)的 配方為：葡萄糖l〇g，Ca3(P04)2 5g，MgCl2. 6H20 5g，KC1 0? 2g，MgS04. 7H20 0? 25g，（NH4)2S04 〇. lg，蒸餾水lOOOmL，pH 7. 0,固體培養(yǎng)基添加1. 5g/100mL的瓊脂。楊樹根際解磷細(xì)菌 P. frederiksbergensis JW-SD2在不同環(huán)境條件下的解磷能力均在NBRIP培養(yǎng)基中進(jìn)行， pH利用lmol *L iCl或NaOH進(jìn)行調(diào)整，裝液量實(shí)驗(yàn)在100mL三角瓶中進(jìn)行，NaCl濃度實(shí)驗(yàn) 使用分析純NaCl試劑。
[0029] 實(shí)施例1 JW-SD2菌株解磷試驗(yàn)
[0030] 將-80°C保存的P.frederiksbergensisJW-SD2菌株活化2次后，接種于LB培養(yǎng) 基，30°C，180r/min培養(yǎng)20h，發(fā)酵液菌體濃度為10scfu.mLi。取lmL發(fā)酵液5000Xg離心 5min，收集菌體，無菌生理鹽水洗滌2次，將菌體重新懸浮于lmL滅菌生理鹽水中，制備成種 子液。按1 %接種量將JW-SD2種子液接入NBRIP培養(yǎng)基，30°C，180r1進(jìn)行震蕩培養(yǎng)， 以不接菌處理作為空白對(duì)照，每隔24h對(duì)取3組重復(fù)進(jìn)行采樣測(cè)定，直到第192h。采用分光 光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液〇D_nm，比濁法測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)量。發(fā)酵液10000Xg離心15min，采用鉬 銻抗比色法測(cè)定上清液可溶性含量，PB-10標(biāo)準(zhǔn)型PH計(jì)測(cè)定上清液pH，可滴定酸法測(cè)定上 清液可滴定酸度。
[0031] 結(jié)果如圖3所示，JW-SD2菌株在72h之前具有較強(qiáng)的解磷能力，最高解磷量達(dá) 7. 75mmol噸\此后JW-SD2菌株解磷量總體呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果顯示 JW-SD2菌株在48h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，96h后細(xì)菌數(shù)量出現(xiàn)