一種新綠原酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種新綠原酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 新綠原酸是從忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾即金銀 花（Flos Lonicerae japonicae)中提取精制得到的產(chǎn)品，是單咖啡酰奎寧酸類化合物，是 金銀花中的主要有機(jī)酸類成分之一。咖啡?？鼘幩犷惢衔锸且活愑煽鼘幩岷筒煌瑪?shù)目的 咖啡酸通過酯化反應(yīng)縮合而成的酚酸類天然化合物，這類化合物廣泛存在于植物之中，具 有顯著的抗氧化活性、抗微生物作用、酶抑制作用、肝細(xì)胞保護(hù)作用、抑制血小板聚集等作 用。咖啡?？鼘幩犷惢衔镌谥参镏蟹植紡V泛，并具體有多種藥理活性，相信隨著對(duì)咖啡酰 奎寧酸類化合物研究的深入和發(fā)展將會(huì)成為新藥開發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。因此，新綠原酸作為咖 啡酰奎寧酸類化合物具有很大的開發(fā)應(yīng)用前景，對(duì)新綠原酸的分離和純化成為其深度開發(fā) 的關(guān)鍵技術(shù)。
[0003] 目前，文獻(xiàn)中沒有關(guān)于新綠原酸的規(guī)模制備方法，有文獻(xiàn)報(bào)道通過多次的高效制 備液相分離從金銀花中得到新綠原酸20. 7mg ;在忍冬葉提取物正丁醇部位通過MCI填料進(jìn) 行多次富集，再經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠色譜進(jìn)一步分離，最后運(yùn)用制備型高效液相從金 銀花中分離得到新綠原酸32mg ;在腫節(jié)風(fēng)提取物中通過運(yùn)用反復(fù)硅膠柱層析及Sephadex LH-20凝膠色譜分離，再利用制備液相分離純化得到新綠原酸5mg ;在山牡荊樹干心中通過 運(yùn)用反復(fù)硅膠、S印hadex LH-20凝膠色譜及反相C18分離得到新綠原酸5mg。這些都是在實(shí) 驗(yàn)室條件下利用反復(fù)常壓硅膠柱、凝膠及半制備液相對(duì)新綠原酸進(jìn)行分離純化；另外，因其 制備的新綠原酸的量都是毫克級(jí)，所以，其工序過程很難具備放大生產(chǎn)的可能性，即使可以 獲得克級(jí)的樣品，也會(huì)因工序繁瑣、制備時(shí)間長(zhǎng)、消耗有機(jī)溶劑多而增加其生產(chǎn)成本。
[0004] 因此，為了更好的開發(fā)利用新綠原酸，在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，研究開發(fā)一種制備 效率高，速度快，生產(chǎn)成本低，無需使用大量的有機(jī)溶劑，從金銀花中快速進(jìn)行新綠原酸的 制備方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本方法首先采用大孔樹脂富集新綠原酸粗品，然后利用中 低壓制備液相快速分離純化獲得高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的新綠原酸單體。其優(yōu)點(diǎn)在于：a，從過程上來 講，本實(shí)驗(yàn)由提取、富集、純化三步完成，不涉及反復(fù)硅膠柱層析，避免了大量有機(jī)溶劑的使 用，減少污染，降低成本，縮短時(shí)間；b，從制備量和純度上來講，30min內(nèi)一次制備就可以達(dá) 到克級(jí)，且制備的純度高達(dá)98. 86%，目前未見有從金銀花中制備高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的新綠原酸及 短時(shí)間內(nèi)一次制備達(dá)到克級(jí)的專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種新綠原酸的制備方法。該方法制得的新綠原酸的純度 達(dá)98. 86%，達(dá)到了含量測(cè)定用對(duì)照品的要求；同時(shí)一次制備所得新綠原酸產(chǎn)品重量達(dá)到 克級(jí)以上，為大量制備高純度的新綠原酸提供了一種新方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種新綠原酸的制備方法，包括如下步驟：
[0008] 步驟a :獲得金銀花提取物；
[0009] 步驟b :取所述金銀花提取物經(jīng)樹脂柱分離，獲得洗脫液；
[0010] 步驟c :取所述洗脫液，用中低壓制備液相分離純化，流動(dòng)相為乙腈-0.5%甲酸水 (ν/V)梯度洗脫，獲得新綠原酸；所述中低壓制備色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為240~360nm。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟b中所述樹脂柱分離的樹脂為非極性樹 脂。
[0012] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟b中所述樹脂柱分離的樹脂為HPD200A型 大孔吸附樹脂。
[0013] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟b中所述樹脂柱分離的洗脫溶劑為水或乙 醇。
[0014] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟b中所述經(jīng)樹脂柱分離具體為：按料液比 Ig :10~20mL，上大孔樹脂柱，先用水洗脫，再用10~95%的乙醇梯度洗脫。收集含有新 綠原酸粗品的水洗脫部位，流速2~4BV/h，洗脫5~10BV。
[0015] 中低壓制備色譜技術(shù)也被稱為閃式制備色譜技術(shù)，分離速度快、效率高，可在短時(shí) 間內(nèi)制備毫克到數(shù)十甚至達(dá)百克的樣品。不但可以應(yīng)用于正相填料也可以應(yīng)用于反相填 料。與常壓柱色譜相比，具有分辨率高、分離速度快的優(yōu)勢(shì)，與高效制備液相相比，具有制備 量大、時(shí)間短的特點(diǎn)。同時(shí)可以自主填充分離柱的填料，增加分離選擇性，節(jié)約生產(chǎn)成本。使 其在天然產(chǎn)物分離純化研究工作中發(fā)揮重要的作用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步 驟C中所述純化為中低壓制備色譜純化，所述中低壓制備色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為240~360nm。
[0016] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟c中所述中低壓制備色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為 326nm〇
[0017] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟c中所述中低壓制備色譜的洗脫系統(tǒng)為乙 腈-0. 5%甲酸水（v/v)溶液，所述乙腈與0. 5%甲酸水溶液的體積比為10:90。
[0018] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟a中所述金銀花提取物的提取方法為取金 銀花醇提，過濾，獲得濾液。
[0019] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟a中所述金銀花提取物的提取方法為取金 銀花與乙醇回流提取，過濾，獲得濾液。
[0020] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以g/mL計(jì)，步驟a中所述金銀花與所述乙醇的 質(zhì)量體積比為1 : (10~30);所述乙醇為乙醇的水溶液，所述乙醇的水溶液中乙醇的體積百 分含量為50 %~95%。
[0021] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，該制備方法采用金銀花用10-30倍量 50 % -95 %乙醇回流提取，過濾，濃縮，HPD200A大孔吸附樹脂分離，乙醇-水梯度洗脫。HPLC 分析檢測(cè)，收集新綠原酸洗脫部位。再利用Reveleris中低壓制備色譜儀（美國(guó)GRACE公 司）進(jìn)行快速制備達(dá)克級(jí)以上。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及純度檢測(cè)，其純度達(dá)98. 86%。
[0022] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟a中所述金銀花提取物的提取方法為：
[0023] 步驟al :取金銀花與50~95% (體積分?jǐn)?shù)）的乙醇回流提取，過濾，獲得濾液，減 壓濃縮至25°C時(shí)的相對(duì)密度為I. 05g · mL S
[0024] 步驟a2 :再與乙醇混合至乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置，過濾，收集濾液減壓濃縮 至無醇味；
[0025] 步驟a3 :取步驟a2所述濾液與水按照體積比為1:1混合，靜置過夜，過濾，獲得濾 液。
[0026] 具體的，取金銀花用10倍量50~95%乙醇回流提取兩次（2h/次），濾過，合并 兩次濾液濃縮至小體積，上HPD200A大孔樹脂，依次用水、20%、40%、95 %的乙醇洗脫。經(jīng) HPLC分析，新綠原酸主要集中在水洗脫部位。然后利用Reveleris中低壓制備色譜儀（美 國(guó)GRACE公司）進(jìn)行快速制備達(dá)克級(jí)以上。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及純度檢測(cè)，其純度達(dá) 98. 86 % 〇
[0027] 具體的，本發(fā)明提供了一種新綠原酸的制備方法，包括如下步驟：步驟a :將金銀 花藥材，按料液比Ig : 10~30mL加入濃度為50 %~95 %乙醇作為提取劑，加熱回流提取兩 次（2h/次），過濾，取上清液濃縮干燥，獲得富含新綠原酸的金銀花乙醇浸膏（相對(duì)于金銀 花藥材，轉(zhuǎn)移率為90. 5~95. 6 % );
[0028] 步驟b :將上述金銀花乙醇浸膏充分分散于蒸餾水中，按料液比Ig : 10~20mL，上 大孔樹脂柱，先用水洗脫，再用10~95%的乙醇梯度洗脫。收集含有新綠原酸粗品的水洗 脫部位，流速2~4BV/h，洗脫5~10BV。濃縮、干燥，獲得新綠原酸粗品（純度為30. 6~ 38. 9% )；
[0029] 步驟c :取上述新綠原酸粗品，用中低壓制備液相分離純化，流動(dòng)相為0. 5%甲酸 水溶液和乙腈，梯度洗脫，快速純化，獲得新綠原酸單體（純度為98. 0~99. 0% )。
[0030] 本發(fā)明提供的新綠原酸的制備方法采用金銀花用10倍量70%乙醇回流提取兩次 (2h/次），濾過，合并兩次濾液濃縮至小體積，上HPD200A大孔樹脂，依次用水、20%、40 %、 95%的乙醇洗脫。經(jīng)HPLC分析，新綠原酸主要集中在水洗脫部位。然后利用Reveleris中 低壓制備色譜儀（美國(guó)GRACE公司）進(jìn)行快速制備達(dá)克級(jí)以上。同時(shí)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及 純度檢測(cè)，其純度達(dá)98. 86%，色譜圖見圖4，ESI-MS圖見圖6。該方法制備的新綠原酸達(dá)到 了含量測(cè)定用對(duì)照品的要求，為大量制備高純度的新綠原酸提供了一種新方法。
【附圖說明】
[0031] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0032] 圖1示新綠原酸制備流程圖；
[0033] 圖2示金銀花提取液HPLC色譜圖；峰1為新綠原酸；
[0034] 圖3示HPD200A純化后的HPLC色譜圖；峰1為新綠原酸；
[0035] 圖4示中低壓制備色譜純化后新綠原酸HPLC色譜圖；峰1為新綠原酸；
[0036] 圖5示新綠原酸對(duì)照品圖；峰1為新綠原酸；
[0037] 圖6示新綠原酸ESI-MS ;
[0038] 圖7新綠原酸對(duì)照品紫外掃描色譜圖；
[0039] 圖8新綠原酸粗品紫外掃描色譜圖；
[0040] 圖9示新綠原酸制備HPLC圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 本發(fā)明公開了一種新綠原酸的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適 當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 是顯而易見的