胞而被誘導(dǎo)。在本公開內(nèi)容的⑶83 方面，CD83被誘導(dǎo)達(dá)至少2%、至少3%、至少4%、6%、7%、8%、9%、10%等。另一方面，不包括這樣 的DC試劑或DC相關(guān)方法，其中通過加載IFN- y處理的癌細(xì)胞無法可檢測(cè)地誘導(dǎo)樹突細(xì)胞 的⑶83。培養(yǎng)基、標(biāo)記抗體、細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充物和其它試劑可獲自例如Sigma-Aldrich，St. Louis, M0, Life Technologies, Carlsbad, CA和GIBC0, Grand Island, NY。K0 DMEM 培養(yǎng)基是"Knockout Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基"。B27培養(yǎng)基描述于例如Stevens等 (2009) Proc. Nat'1. Acad. Sci. 106:16568-16573和Brewer等（1993)了.如證〇8(^. Res. 35:567-576。Glutamax?是L-丙氛醜基-L-谷氛醜胺。
[0073] 加載樹突細(xì)胞 樹突細(xì)胞（DC)可用黑素瘤腫瘤細(xì)胞抗原加載，可制備DC疫苗，并可通過一種或多 種給藥途徑將DC疫苗給予人類受試者。參見例如Selvan等（2008) Int. J. Cancer. 122:1374-1383 ;Sabado和Bhardwaj (2010) Immunotherapy. 2:37-56 ;Hirschowitz等 (2004) J. Clin. Oncol. 22:2808-2815 ;0, Neill等（2004) Blood. 104:2235-2246; Schwaab等（2009) Clin. Cancer Res. 15:4986-4992 ;Zhong等（2007) Clin. Cancer Res. 13:5455-5462。
[0074] 本公開內(nèi)容提供其中腫瘤細(xì)胞被滅活（例如通過放射、核酸交聯(lián)劑、多肽接頭 或這些的組合）的組合物和方法。一種具體的核酸烷基化劑（alkylator)是丙氨 酸，N-(叮啶-9-基），2-[雙（2-氯乙基）氨基]乙酯。示例性的交聯(lián)劑，例如與紫外線 (UVA)照射組合的補(bǔ)骨脂素具有交聯(lián)DNA但保留蛋白質(zhì)未被修飾的能力。核酸靶向的化合 物可為4' -(4-氨基-2-氧雜）丁基-4, 5'，8-三甲基補(bǔ)骨脂素（"S-59")?？捎?50微摩 爾的補(bǔ)骨脂素S-59 和 3J/cm2UVA光（FX1019 照射裝置，BaxterFenwal，RoundLake，IL) 使細(xì)胞滅活。參見Dubensky的美國(guó)專利號(hào)7, 833, 775和Dubensky的7, 691，393,其通過引 用以其整體結(jié)合到本文中。
[0075] 腫瘤抗原 本公開內(nèi)容提供用于刺激針對(duì)腫瘤抗原的免疫應(yīng)答、用于刺激針對(duì)表達(dá)腫瘤抗原的細(xì) 胞的免疫應(yīng)答、用于給予人或獸醫(yī)受試者和用于診斷人或獸醫(yī)受試者等的試劑和方法。本 公開內(nèi)容提供用于刺激針對(duì)表達(dá)以下一種或多種的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的試劑和相關(guān)方法：例 如p53、MUC1、NY-ES0-1、c-myc、存活蛋白（surviving)、p62、細(xì)胞周期蛋白B1 和Her2/neu (參見例如Reuschenbach等（2〇〇9)CancerImmunol.Immunother. 58:1535_1554)。在 一些示例性的實(shí)施中，免疫應(yīng)答針對(duì)表達(dá)所述一種或多種抗原的細(xì)胞，但不必對(duì)該細(xì)胞有 特異性（免疫應(yīng)答也針對(duì)其它細(xì)胞）。在其它示例性的實(shí)施中，免疫應(yīng)答針對(duì)表達(dá)所述一種 或多種抗原的細(xì)胞，且其中免疫應(yīng)答需要識(shí)別所述抗原。在另外其它示例性的實(shí)施中，免疫 應(yīng)答針對(duì)表達(dá)所述一種或多種抗原的細(xì)胞，且其中免疫應(yīng)答不需要識(shí)別所述抗原。
[0076] 本公開內(nèi)容提供用于刺激針對(duì)表達(dá)熱激蛋白（HSP)的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的試劑 和方法。針對(duì)HSP的免疫療法針對(duì)結(jié)腸直腸癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌是有效的（參見例 如Buonaguro等（2011)ClinicalVaccineImmunol. 18:23-34)。包括用于刺激針對(duì) 癌-睪丸抗原、或針對(duì)分化抗原、或針對(duì)過量表達(dá)的抗原、或針對(duì)腫瘤相關(guān)糖抗原的免疫 應(yīng)答的試劑和方法。在其它示例性的實(shí)施中，提供刺激針對(duì)表達(dá)MUC1的腫瘤性病癥的免 疫應(yīng)答的試劑和方法，所述MUC1為一種與乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌相 關(guān)的抗原（Reuschenbach等（2009)CancerImmunol.Immunother. 58:1535-1554)。還 提供刺激針對(duì)表達(dá)P53的腫瘤性病癥的免疫應(yīng)答的試劑和方法，所述p53為一種與肺癌、 結(jié)腸直腸癌、食管癌和卵巢癌有關(guān)的抗原（Reuschenbach等，同上）。此外，提供刺激針 對(duì)表達(dá)Her2/neu的腫瘤性病癥的免疫應(yīng)答的試劑和方法，所述Her2/neu為一種與乳腺 癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌有關(guān)的抗原。在示例性的實(shí)施中，本公開內(nèi)容提供用于刺激針 對(duì)下列抗原或針對(duì)表達(dá)所述抗原的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的試劑和方法，其中所述抗原為MAGE 家族抗原。MAGE意指"黑素瘤相關(guān)抗原"。MAGE家族抗原與黑素瘤（Selvan等（2008) Int.J.Cancer. 122:1374-1383)以及與肝細(xì)胞癌（參見例如Mou等（2002)Brit.J. Cancer. 86:110-116)、卵巢癌（Zhang等（2010)BMCCancer. 10:163 (6 頁）、非小細(xì) 胞肺癌（NSCLC)(Gridelli等（2009)TheOncologist. 14:909-920;Sienel等（2007) Clin.CancerRes. 13:3840-3847)和結(jié)腸直腸癌（Toh等（2009)Clin.CancerRes. 15:7726-7736)有關(guān)。
[0077] ⑶133是一種由多種癌癥表達(dá)的抗原，包括黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、尤因肉瘤、肝細(xì) 胞癌（HCC)、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)和卵巢癌（Perego等（2011)J.Inv.Dermatol.11: 546-547;Cao,等（2011)BMCGastroenterol.11: 71 (11 頁）；Lorico和Rappa(2011) 135039 (6 頁）；Ferrandina等（2009)BMCCancer.9:221 (9 頁））。本公開內(nèi)容提供表 達(dá)⑶133的癌干細(xì)胞群；至少一種加載表達(dá)⑶133的癌干細(xì)胞的樹突細(xì)胞；用于制備加載 表達(dá)⑶133的癌干細(xì)胞的樹突細(xì)胞的方法；和將至少一種加載表達(dá)⑶133的癌干細(xì)胞的樹 突細(xì)胞給予患有表達(dá)CD133生物標(biāo)志物的癌癥的受試者的方法。
[0078]至于ABCB5抗原，本公開內(nèi)容提供這樣試劑和方法，其中表達(dá)ABCB5的癌干細(xì)胞 與樹突細(xì)胞接觸或加載到樹突細(xì)胞中，且其中將加載的樹突細(xì)胞給予患有表達(dá)ABCB5的癌 癥的人類受試者或動(dòng)物。ABCB5表達(dá)與例如黑素瘤癌干細(xì)胞（Schatton等（2010)Cancer Res. 70:697-708)以及與結(jié)腸直腸癌（Wilson等（2011)CancerRes. 71: 5307-5316)有 關(guān)。相關(guān)方法包括誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)ABCB5的細(xì)胞、優(yōu)選表達(dá)ABCB5的癌干細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
[0079] 本公開內(nèi)容還包括與下列抗原有關(guān)的試劑和方法：醛脫氫酶（ALDH)，例如 ALDH1A3;ABCB1 (P-糖蛋白/MDR1) ;BCL2A1;SNAI2(slug);ATM、CHEK1和CHEK2。還包括與 0)44、0)133、0)24、0)49€434、0)166和譜系組（111^^86?31161)有關(guān)的試劑和方法。譜系 組包括 〇)45、〇)31、〇)3、〇)64、〇)10、〇)16、〇)18和6?厶；〇)45、〇)31、〇)14(^和了61119;〇)45、 ⑶31和⑶140a。通常譜系組包括⑶45、⑶31、⑶3、⑶64、⑶10、⑶16、⑶18、GPA、⑶140a和 Terll9的一種或多種（Diehn等人的US 2011/0124032,其通過引用以其整體結(jié)合到本文 中）。
[0080] 還包括對(duì)刺激針對(duì)下列抗原的一種或多種或針對(duì)表達(dá)下列抗原的一種或多種 的細(xì)胞的免疫應(yīng)答是特異性的試劑和相關(guān)方法：MAGE-A亞型，例如MAGE-A1、MAGE-A2、 MAGE-A3/6、MAGE-A4和MAGE-A12 (參見例如Siene1等，同上）。在備選的示例性實(shí)施中，本 公開內(nèi)容提供刺激針對(duì)胞間粘附分子-1 (ICAM-1)、或針對(duì)表達(dá)ICAM-1的細(xì)胞、或針對(duì)腫 瘤細(xì)胞、或針對(duì)被鑒定具有一種或多種ICAM-1的受試者的癌癥的試劑和相關(guān)方法。ICAM-1 相關(guān)癌癥包括黑素瘤、結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌和肝細(xì)胞癌（Shih等（2004)KoreanJ. Intern.Med. 19:48-52)。此外，本公開內(nèi)容提供用于刺激針對(duì)下列抗原、或針對(duì)表達(dá)下列 抗原的細(xì)胞、或針對(duì)腫瘤細(xì)胞、或針對(duì)鑒定具有sHLA-E的受試者的癌癥的免疫應(yīng)答的試劑 和方法。sHLA-E是一種與黑素瘤、結(jié)腸直腸癌和腎癌有關(guān)的非經(jīng)典的MHCI類分子（Allard 等（2011)PLoSOne. 6:e21118 (9頁））。還提供用于刺激針對(duì)下列抗原、或針對(duì)表達(dá)下列 抗原的細(xì)胞、或針對(duì)表達(dá)下列抗原的腫瘤細(xì)胞、或針對(duì)表達(dá)下列抗原的受試者的癌癥的應(yīng) 答的試劑和方法。所述抗原是ffiRV-Kgag相關(guān)NG0-Pr-54。該抗原與卵巢癌、前列腺癌和 白血病有關(guān)（Ishida等（2008)CancerImmunol. 8:15 (10 頁））。
[0081] 本公開內(nèi)容提供用于刺激針對(duì)是如下的癌細(xì)胞、或針對(duì)是如下的受試者的癌癥 的免疫應(yīng)答的試劑和相關(guān)方法。示例性的實(shí)施包括而不限于：（1)黑素瘤和結(jié)腸直腸癌； (2)黑素瘤和卵巢癌；（3)黑素瘤和肺癌；（4)黑素瘤和肝癌；（5)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌和卵 巢癌；（6)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌和肺癌；（7)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌和肝癌；（8)黑素瘤、肺癌和 肝癌；(9)黑素瘤、卵巢癌和肺癌；（10)黑素瘤、卵巢癌和肝癌；（11)黑素瘤、卵巢癌、肺癌 和肝癌；（12)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、肺癌和肝癌；（13)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌和肝癌； (14)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌和肺癌；以及（15)黑素瘤、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、肺癌和肝 癌。
[0082] 排斥性的示例性實(shí)施是不誘導(dǎo)或表明無法誘導(dǎo)預(yù)定水平的免疫應(yīng)答的試劑和方 法。例如，可針對(duì)是黑素瘤細(xì)胞、結(jié)腸直腸癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞或肝癌細(xì)胞的癌細(xì) 胞的一種或多種，來評(píng)價(jià)免疫應(yīng)答的預(yù)定水平。作為非限制性定義，預(yù)定水平刺激可為例如 是低于20%、低于15%、低于10%、低于5%、低于2%、低于1%最高水平的刺激。最高水平可用通 過RECIST標(biāo)準(zhǔn)顯示最大反應(yīng)的人類受試者的比例表示、用人類受試者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中癌干 細(xì)胞的殺死表示、用總體生存表示、用無進(jìn)展生存期（PFS)表示、用至疾病進(jìn)展時(shí)間（TTP) 表示、用最大細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL)反應(yīng)信號(hào)表示、用最大ELISPOT測(cè)定信號(hào)表示、用來 自抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)的最大結(jié)果表示、用T細(xì)胞活化表示、用T細(xì)胞擴(kuò)增表示、用 胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS)測(cè)定法表示、用四聚體測(cè)定法表示等（參見例如Nomura等（2008) CytometryA. 73:984-991)。例如，在一個(gè)示例性的實(shí)施中，不包括刺激低于預(yù)定最高水平 20%的試劑和方法。詳細(xì)描述了臨床終點(diǎn)（例如PFS、TTP、至遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移時(shí)間、總體生存）和 用于解釋這些終點(diǎn)的技術(shù)（Brody(2012)ClinicalTrials:StudyDesign,Endpoints andBiomarkers.Elsevier,SanDiego,CA)，且這些是本公開內(nèi)容的一部分。
[0083] 本公開內(nèi)容所包括的試劑、方法和技術(shù)包括Sugaya等人的US2011/0313229,其 涉及癌干細(xì)胞；Weismann和Boiko的W0 2011/041453,其涉及黑素瘤癌干細(xì)胞的分離；以 及Blot-Chabaud等人的US2011/0286963,其涉及CD146。這些的每一個(gè)通過引用以其整 體結(jié)合到本文中。
[0084] 可通過疏水材料和非生物淤積材料，例如聚苯乙烯、薄的瓊脂涂料、硅氧烷、含氟 聚合物、聚乙烯等，提供非貼壁條件、非貼壁板、非貼壁涂料等。參見例如Tsai等（2009)J. Biomater.Sci.Polym.Ed. 20:1611-1628;授予Toreki等人專利權(quán)的US7, 790,217、授 予Zamora等人專利權(quán)的US6, 342, 591、Jiang等人的US2011/0282005,其每一份均通過 引用以其整體結(jié)合到本文中。Kim等（2006)LabChip. 6:1432-1437公開了用于非貼壁的 聚乙二醇（PEG)。超低附著表面包括CorningUltra-LowAttachmentSurface(Corning, Inc.)和ThermoScientific'sNuncHydroCellSurface。
[0085] 在示例性的實(shí)施中，本公開內(nèi)容提供可促進(jìn)非貼壁條件的添加劑，例如是膜擴(kuò)展 劑（membraneexpander)的添加劑、表面活性劑、PluronicF-68、Tween-80或聚乙稀醇 (PVA)(SigmaAldrich目錄，St.Louis,M0)。
[0086] 在示例性的實(shí)施中，可通過丁酸鈉、C0X-2抑制劑、反義核酸、si-RNA或微小RNA， 實(shí)現(xiàn)吲哚胺-吡咯2, 3-雙加氧酶的減量調(diào)節(jié)?？赏ㄟ^反義核酸、si-RNA或微小RNA影響 IL-10 或TGF-0 的減量調(diào)節(jié)。Liu等（2011)FEBSLett. 585:1963-1968 公開了微小RNA 減量調(diào)節(jié)IL-10表達(dá)的用途。Yu等（2012)Carcinogenesis. 33:68-76公開了微小RNA通 過減量調(diào)節(jié)TGF-P受體以降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-P)的功效的用途。Lang等（2011) Biochim.Biophys.Res.Commun. 409:448-453 報(bào)告了小干擾RNA(siRNA)抑制TGF-0 表達(dá)的用途。
[0087] 在示例性的實(shí)施中，以單細(xì)胞開始進(jìn)行擴(kuò)增過程。在其它示例性的實(shí)施中，以約10 個(gè)細(xì)胞、約20個(gè)細(xì)胞、約50個(gè)細(xì)胞、約100個(gè)細(xì)胞、約200個(gè)細(xì)胞、約500個(gè)細(xì)胞、約1000 個(gè)細(xì)胞、約2000個(gè)細(xì)胞、約5000個(gè)細(xì)胞、約10000個(gè)細(xì)胞、約20000個(gè)細(xì)胞、約50000個(gè)細(xì) 胞等開始擴(kuò)增過程。
[0088] 提供排斥性的示例性實(shí)施。在沒有暗示任何限制的情況下，本公開內(nèi)容的試劑和 方法可排除其中CD146的表達(dá)低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、 低于5%或低于2%的細(xì)胞群、組織、器官或受試者等。此外，可排除其中⑶271的表達(dá)低于 50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的細(xì)胞群、組織、器 官或受試者等。在又一個(gè)排斥性的示例性實(shí)施中，可排除其中CD146和CD271兩者的共表 達(dá)（對(duì)于所測(cè)量的每個(gè)細(xì)胞，在確切相同的細(xì)胞中共表達(dá)）低于50%、低于40%、低于30%、低 于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的細(xì)胞群、組織、器官或受試者等。此外，可排 除其中CD146和CD271兩者的表達(dá)（在確切相同的細(xì)胞中共表達(dá)，或兩者只在整個(gè)細(xì)胞群 中表達(dá)）低于50%、低于40%、低于30%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%或低于2%的 細(xì)胞群、組織、器官或受試者等。
[0089] 術(shù)語"共表達(dá)"是指其中指定的標(biāo)志物，例如基因、多肽、抗原等等在確切相同的細(xì) 胞中表達(dá)，并且還同時(shí)表達(dá)的情況。至于同時(shí)共表達(dá)，共表達(dá)的時(shí)間范圍可為約5分鐘、約 30分鐘、約1小時(shí)、約6小時(shí)、約12小時(shí)、約1天、約2天、約4天、約8天等。共表達(dá)的時(shí)間 范圍可為至少1分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少20分鐘、至少60分鐘、至少2小時(shí)、 至少4小時(shí)、至少6小時(shí)、至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、至少2天、至少3天、至少4天、至少 8天、至少1周、至少2周等。
[0090] 本公開內(nèi)容提供來源于人黑素瘤腫瘤的分離的細(xì)胞群，其中所述群中至少20%的 細(xì)胞表達(dá)⑶146,且至少20%的細(xì)胞表達(dá)⑶271，或其中至少20%的細(xì)胞共表達(dá)⑶146和 CD271。還提供來源于人黑素瘤腫瘤的分離的細(xì)胞群，其中所述群中至少30%的細(xì)胞表達(dá) ⑶146,且至少30%的細(xì)胞表達(dá)⑶271，或其中至少40%的細(xì)胞共表達(dá)⑶146和⑶271。還提 供來源于人黑素瘤腫瘤的分離的細(xì)胞群，其中所述群中至少40%的細(xì)胞表達(dá)⑶146,且至少 30%的細(xì)胞表達(dá)⑶271，或其中至少40%的細(xì)胞共表達(dá)⑶146和⑶271。本公開內(nèi)容包括而 不限于作為單層或其它層存在的細(xì)胞群、作為懸液存在的細(xì)胞群、作為一個(gè)或多個(gè)球體存 在的細(xì)胞群等。
[0091] 可檢測(cè)地表達(dá)⑶146或⑶271中的唯--個(gè)的細(xì)胞群 本公開內(nèi)容包括表達(dá)CD146但不表達(dá)CD271的細(xì)胞群。此外，本公開內(nèi)容包括表達(dá) ⑶271但不表達(dá)⑶146的細(xì)胞群。在實(shí)施方案中，包括這樣的細(xì)胞群，其中至少20%的細(xì)胞 表達(dá)CD146,其中至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少 95%、至少98%的細(xì)胞表達(dá)⑶146但不表達(dá)⑶271。此外，包括這樣的細(xì)胞群，其中至少20%的 細(xì)胞表達(dá)CD146、其中至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、 至少95%、至少98%的細(xì)胞表達(dá)⑶1271但不表達(dá)⑶146。包括培養(yǎng)上述細(xì)胞的方法、分離該 細(xì)胞的方法、將該細(xì)胞加載到樹突細(xì)胞上的方法、包含上述細(xì)胞的疫苗、包含加載了上述細(xì) 胞的樹突細(xì)胞的疫苗、用于將疫苗給予受試者的方法等。
[0092] 作為⑶146+/⑶271-的黑素瘤細(xì)胞鑒定間充質(zhì)癌細(xì)胞，作為⑶146+/⑶271+的黑 素瘤細(xì)胞鑒定是具有間充質(zhì)特性的癌干細(xì)胞的細(xì)胞。本公開內(nèi)容提供細(xì)胞群和相關(guān)方法， 其中所述群中至少20%的細(xì)胞為CD146+/CD271-，至少22%、至少24%、至少26%、至少28%、至 少30%、至少34%、至少38%、至少42%、至少46%、至少50%、至少54%、至少58%、至少62%、至少 66%、至少70%、至少74%、至少78%或至少82%的細(xì)胞為CD146+/CD271-。本公開內(nèi)容提供細(xì) 胞群和相關(guān)方法，其中所述群中至少20%的細(xì)胞為⑶146-/⑶271+，至少22%、至少24%、至 少26%、至少28%、至少30%、至少34%、至少38%、至少42%、至少46%、至少50%、至少54%、至少 58%、至少62%、至少66%、至少70%、至少74%、