治療和修復(fù)肌腱的組合物和方法
【專利說明】治療和修復(fù)肌腱的組合物和方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)要求2013年2月12日提交的美國臨時專利申請N0.61/763，908的權(quán)益，將其以引用的方式整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及修復(fù)肌腱的組合物和方法，更具體涉及用于肌腱治療和修復(fù)以及肌腱損傷的預(yù)防的包含非球形真皮鞘(NBDS)細(xì)胞的組合物。
[0004]背景
_5] 相關(guān)技術(shù)描述
[0006]肌腱是纖維結(jié)締組織的堅韌條帶，其通常將肌肉與骨骼相連。常見肌腱的實例包括將小腿肌肉與跟骨相連的跟腱，以及將膝蓋骨與脛骨相連的髕腱。
[0007]許多途徑都可以使肌腱受到損傷，包括例如由于過度使用、扭傷、疾病和一般老化。術(shù)語“肌腱病”可用于指許多損傷，包括由炎癥和輕微撕裂引起的那些損傷。肌腱也可能斷裂或撕裂，通常需要使用外科方法治療。
[0008]雖然許多外科方法可用于肌腱損傷的治療，但是如果要肌腱完全治愈，即使用這些方法也會耗費幾年。本發(fā)明公開了治療肌腱損傷的新型組合物和方法，并且還提供了其它相關(guān)優(yōu)勢。
[0009]概述
[0010]簡單來說，本發(fā)明提供利用毛囊來源的非球形真皮鞘(“NDBS”)細(xì)胞治療或預(yù)防肌腱損傷的組合物和方法。在本發(fā)明的一方面，提供包括下述步驟的方法:(a)準(zhǔn)備有活力的(即活的)毛發(fā)，和(b)培養(yǎng)有活力的毛發(fā)以便獲得NBDS細(xì)胞群。在優(yōu)選實施方案中，將NBDS細(xì)胞分離。
[0011]在本發(fā)明的一個方面，提供用于分離NBDS細(xì)胞的方法，其包括下述步驟:(a)準(zhǔn)備有活力的毛發(fā)；(b)將步驟(a)中準(zhǔn)備的毛發(fā)切割(cleave)以移出毛囊的球部(其包含真皮鞘杯和真皮乳頭)；(c)分離非球形真皮鞘組織；和(d)培養(yǎng)所述分離的非球形真皮鞘組織以產(chǎn)生NBDS細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過來自對象枕部頭皮的活體組織檢查獲得有活力的毛發(fā)。在另一實施方案中，使用顯微操縱器和手術(shù)刀將毛發(fā)切割。然而在其它的實施方案中，本文提供的方法還包括下述步驟:任選地，用例如膠原消化酶(如膠原酶、分散酶和亮抑酶肽)將分離的非球形真皮鞘組織進(jìn)行酶消化。在進(jìn)一步的實施方案中，將細(xì)胞多次傳代。
[0012]在本發(fā)明其它方面，提供分離的NBDS細(xì)胞，任選地根據(jù)上文描述的方法制備，其中將所述細(xì)胞分離以提供對于⑶90、⑶73和⑶49b中的一種或多種主要為陽性的細(xì)胞群，和/或?qū)τ贑D34、CD45和KRT14中的一種或多種主要為陰性的細(xì)胞群(任選在培養(yǎng)前或培養(yǎng)后)。在優(yōu)選實施方案中，所述分離的NBDS細(xì)胞對于上文描述的陽性標(biāo)志物中的一種或多種至少70%、80%、90%、95%、98%或100%為陽性，和/或?qū)τ谏衔拿枋龅年幮詷?biāo)志物中的一種至少80%、90%、95%或98%為陰性。
[0013]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，分離的NBDS細(xì)胞在細(xì)胞群中有少于15%、10%、5%或1%的角質(zhì)細(xì)胞，和/或在細(xì)胞群中有少于15%、10%、5%或1%的黑色素細(xì)胞。然而，在進(jìn)一步的實施方案中，分離的NBDS細(xì)胞來源于含有一些污染細(xì)胞類型的真皮細(xì)胞群(優(yōu)選來源于毛囊)，包括例如，在細(xì)胞群中有至少1、5、10、0.01%、0.1%或I %的角質(zhì)細(xì)胞，和/或在細(xì)胞群中有至少5、10、0.1%、0.1 %的黑色素細(xì)胞。在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案中，分離的NBDS細(xì)胞純度為至少95%，并且在細(xì)胞群中有至少一種污染細(xì)胞類型(例如，至少一種角質(zhì)細(xì)胞)。
[0014]這些NBDS細(xì)胞(或分離的NBDS細(xì)胞)可與其它組分一同存在于組合物中，例如血漿、纖維蛋白和/或透明質(zhì)酸。在其它實施方案中，NBDS細(xì)胞(或分離的NBDS細(xì)胞)可能構(gòu)成適合注射的組合物，例如乳酸林格氏液或鹽水緩沖液?？杀挥糜谛纬杀景l(fā)明的組合物的其它成分包括，例如細(xì)胞外基質(zhì)組分(如葡糖氨基葡聚糖(GAGs)、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角蛋白、透明質(zhì)酸、白蛋白(如人白蛋白)、彈性蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白)、細(xì)胞因子和趨化因子(如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和它的亞型、胰島素樣生長因子(IGF)和它的亞型、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白、肝細(xì)胞生長因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬細(xì)胞刺激蛋白(MSP)、表皮生長因子(EGF)、白介素-6 (IL-6)、基質(zhì)細(xì)胞源性因子-1 (SDF-1)、血小板源性生長因子(TOGF)和纖維母細(xì)胞生長因子(FGF)和/或各種治療劑(如止痛劑、抗炎劑和免疫調(diào)節(jié)劑)。然而在其它的實施方案中，將NBDS細(xì)胞(以及分離的NBDS細(xì)胞)提供至不含上文提及的任何成分(包括例如，血清或血漿)的組合物中。
[0015]然而在本發(fā)明的其它方面，提供了治療或預(yù)防肌腱損傷的方法，該方法包括下述步驟:向?qū)ο笫┯冒衔拿枋龅腘BDS細(xì)胞(在優(yōu)選實施方案中為分離的NBDS細(xì)胞)的組合物。在一個實施方案中，所述對象為選自人、馬、豬、狗、貓、豚鼠、兔子、大鼠和小鼠的哺乳動物。
[0016]在本發(fā)明不同的實施方案中，肌腱損傷為肌腱斷裂或撕裂，或選自肌腱變性、腱鞘炎和撕裂的其它損傷。而在其它實施方案中，肌腱為跟腱或髕腱。在其它實施方案中，肌腱為屈肌腱或伸肌腱。而在其它實施方案中，肌腱損傷應(yīng)被理解為包括多種肌腱相關(guān)疾病(包括肌腱病、肌腱變性、肌腱炎、腱鞘炎、腱圍炎、具有肌腱變性的腱圍炎和肌腱輕微撕裂)，其也可利用本文提供的組合物進(jìn)行治療。可被治療的代表性肌腱包括，例如:a)跟腱(如跟腱中部病、跟腱腱圍病、跟腱止點病、跟骨后滑囊炎、表面跟骨滑囊炎)；b)肩部肌腱(如二頭肌腱病、肩袖肌腱病)；c)肘部肌腱(如內(nèi)側(cè)上髁炎或外側(cè)上髁炎或網(wǎng)球肘)；
d)手部和腕部(如屈肌/伸肌腱病、屈肌/伸肌腱鞘炎、德奎爾萬氏病和掌腱膜攣縮癥(Dupuytren's contracture)) ；e)發(fā)生或未發(fā)生輕微撕裂的腿筋和髕腱肌腱??；和f)發(fā)生或未發(fā)生輕微撕裂的足底筋膜炎。
[0017]將在下文的描述闡述一個或多個實施方案的詳細(xì)說明。根據(jù)所述描述、附圖和權(quán)利要求，其它的特征、目的和優(yōu)勢將是顯而易見的。此外，本文參考的所有專利和專利申請的公開內(nèi)容通過弓I用整體并入本文。
【附圖說明】
[0018]圖1顯示人毛囊的解剖。圖1A顯示分離的人毛囊，可將其在毛根的球部以上(即在真皮乳頭細(xì)胞和真皮鞘杯細(xì)胞以上)，皮脂腺管基部以下切割，以獲得分離的真皮鞘(參見圖1B)。圖1B中描述的結(jié)構(gòu)可分為至少兩個單獨的部分，如圖1C和ID所示。圖1C描述了毛發(fā)纖維和相連的內(nèi)毛根鞘以及主要包括角質(zhì)細(xì)胞的外毛根鞘，圖1D為含有NBDS細(xì)胞的真皮鞘(偶爾也被稱為結(jié)締組織鞘)。
[0019]圖2是毛囊的圖解，描述了真皮乳頭(“DP”)細(xì)胞、真皮鞘杯(“DSC”)細(xì)胞和非球形真皮鞘(“NBDS”)細(xì)胞的來源。
[0020]圖3是培養(yǎng)物中的NBDS細(xì)胞的顯微照片。
[0021]圖4顯示了 NBDS細(xì)胞，針對膠原的產(chǎn)生將其染色。更具體地，在5天(圖4A)和12天(圖4B)之后，將NBDS/血漿凝膠混合物輕輕地拉伸。圖4B中的細(xì)胞明顯暗于圖4A中的那些細(xì)胞，這顯示I型膠原的產(chǎn)生。
[0022]發(fā)明詳述
[0023]如上文指出的，本發(fā)明提供治療和預(yù)防哺乳動物肌腱損傷的毛囊來源的非球形真皮鞘(NBDS)細(xì)胞。然而在闡明本發(fā)明之前，首先闡明下文中使用的某些術(shù)語的定義可能有助于理解本發(fā)明。
[0024]非球形真皮鞘細(xì)胞或“NBDS”細(xì)胞指真皮來源的細(xì)胞(或更具體地，來源于毛囊)。在優(yōu)選實施方案中，從毛囊的外真皮鞘獲得鞘細(xì)胞，在毛根的球部以上(即，在真皮乳頭和真皮鞘杯細(xì)胞以上)，但是在皮脂腺管基部以下。可以通過許多方法容易地鑒定NBDS細(xì)胞，包括例如，通過制備和培養(yǎng)的方法(如下文所述)、形態(tài)學(xué)方法(參見如圖3)，以及特異性標(biāo)志物(如，在培養(yǎng)之前或之后，對于⑶90、⑶73和⑶49b，NBDS細(xì)胞主要為陽性，和/或?qū)τ冖?4、⑶45和KRT14，NBDS細(xì)胞主要為陰性)的方法。然而在所有的事件中，所述細(xì)胞必須是真皮來源的，更具體地，是毛囊來源的。
[0025]擴(kuò)增的非球形真皮鞘細(xì)胞或“eNBDS細(xì)胞”指在培養(yǎng)中經(jīng)過多次傳代的NBDS細(xì)胞，但其仍具有產(chǎn)生膠原(如I型膠原)以及各種細(xì)胞因子和趨化因子的能力。如上，出乎意料地，所述eNBDS細(xì)胞也具有免疫調(diào)節(jié)能力。在優(yōu)選實施方案中，在培養(yǎng)中細(xì)胞可以傳代1、2、3、4、5、10、20 或更多代。
[0026]“分離的”NBDS細(xì)胞指含有高于70%、80%、90%、95%、98%或100%的NBDS細(xì)胞的細(xì)胞群。NBDS細(xì)胞具有產(chǎn)生膠原(如I型膠原)以及多種細(xì)胞因子和趨化因子的能力。出人意料地，NBDS細(xì)胞也具有免疫調(diào)節(jié)能力，這使它們特別適合用于肌腱損傷的治療(如通過幫助抑制任何炎癥反應(yīng))。
[0027]在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用能使細(xì)胞在微觀范圍可見的軟件或其它可視技術(shù)來評估一個視野中大量細(xì)胞的尺寸、形狀、生活力和粒度，以及確定NBDS細(xì)胞(其為如圖3所示的成纖維細(xì)胞樣，不同于角質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、DSCs和不同形態(tài)的其它細(xì)胞類型)的數(shù)量。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，提供用于分離NBDS細(xì)胞的方法，該方法包括將來自毛囊的細(xì)胞培養(yǎng)至少1、2、3、4、5、6、10或20代，從而產(chǎn)生分離的NBDS細(xì)胞群。在優(yōu)選實施方案中，將所述細(xì)胞置于允許NBDS細(xì)胞貼壁的皿或瓶中，從而隨著每次傳代，將非貼壁細(xì)胞移出，并釋放(例如通過胰蛋白酶消化)剩余的貼壁細(xì)胞，然后加入新鮮