t株全基因組序列為SEQIDNo. 1所示。
[01%] 本發(fā)明將獲得的基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NPA18+F?t提交中國典 型培養(yǎng)物保藏中屯、進行保藏，其微生物保藏編號為；CCTCCN0 ;V201505。
[0127]實施例3MG7-NPA18+F-ut標記疫苗株對SPF雞免疫效果實驗 [012引 1、實驗方法
[0129] 為測定本發(fā)明實施例2救獲的MG7-NPA18+F?t標記疫苗株（微生物保藏編號為： CCTCCNO;V201505 ;對4周齡SPF雞的免疫保護性，利用9日齡SPF雞胚擴增病毒，收集尿 囊液，測得該標記疫苗株的EIDg。為5. 62X10 7mU制備成疫苗時將病毒稀釋至3. 16X1(^7 rnL〇
[0130] 病毒稀釋后滅活，具體操作為：先將分析純甲醒（無結(jié)晶）溶液用滅菌生理鹽水 作1 ;10稀釋，再將稀釋后的甲醒溶液加入到病毒液中，邊加邊搖，使甲醒溶液的終濃度為 0. 15% (如向99血病毒液中加入1:10稀釋的甲醒溶液1血即可）。充分混勻后移入另一 個無菌瓶中，密封后于37°C水浴滅活16h，間隔4-化振搖一次。病毒液置2~8°C保存。取 滅活后的MG7-NPA18+F?t株病毒液，具體方法為：水相制備；將滅活后檢驗合格的抗原置 于滅菌燒杯中，加入水相體積4%的吐溫-80,充分振搖，使吐溫-80完全溶解為止，即為水 相（30ml)。乳化制苗；取油相2份化0ml)置于滅菌燒杯中，使用IKAT18B型乳化機進行 乳化，調(diào)至3檔（13500巧m)lmin內(nèi)加完水相，然后調(diào)至4檔（17500巧m)乳化5min，將制備 好的疫苗2-8°C保存。LaSota組的疫苗制備及病毒含量與MG7-NPA18+F-ut標記疫苗株相 同。
[013U 將SPF雞分別免疫MG7-NPA18+F-ut(300yL，皮下注射）、LaSota(300yL，皮下注 射）、MG7-NPA18+F-ut(20yL，肌注）和LaSota(20yL，肌注）各20只，另設(shè)非免疫對照組 20只，免疫組和非免疫組分別飼養(yǎng)于空氣負壓過濾隔離器中。免疫后21d翅靜脈采血分離 血清按常規(guī)檢測NDV特異HI抗體。
[0132] 另外，在免疫后21d將免疫組和對照組分別進行分組，每組10只，分別用強毒NDV F48E9和NDVVII-74(本發(fā)明人實驗室保存用種毒）WlX10巧IDw劑量經(jīng)肌肉注射途徑進 行攻毒，觀察兩周，統(tǒng)計發(fā)病與死亡情況。
[0133] 2、實驗結(jié)果
[0134] 滅活疫苗MG7-NPA18+F-ut和LaSota分別免疫SPF雞，免疫后觀察21d，免疫組所 有維雞無任何異常，飼料消耗及生長發(fā)育與非免疫對照組無明顯差異。
[01巧]免疫后21d檢測血清NDV特異HI抗體水平，MG7-NP A 18+F-ut免疫組抗體效價高 于LaSota組（表巧。
[0136] 表5MG7-NPA18+F-ut標記疫苗株和LaSota株的免疫原性結(jié)果
[0137]
[01義
[0139] *接種劑量；分別為300化/只和20yL/只；
[0140] **免疫3周后翅下靜脈采血，測定HI滴度，計算平均值。
[0141] 8組免疫組攻毒后未出現(xiàn)任何發(fā)病或死亡，完全保護（10/10)，同日齡非免疫對照 組則全部發(fā)病死亡（0/10)(表6)。
[0142] 表6MG7-NPA18+F?t標記疫苗株和LaSota株的攻毒保護性試驗結(jié)果
[0143]
[0144] *4周齡SPF維雞，分別經(jīng)頸部皮下和肌肉注射途徑接種MG7-NPA18+F-ut疫苗；
[0145] **翅下靜脈采血，測定HI滴度，計算平均值；
[0146] ***免疫后S周，分別用NDVF48E9和NDVVII-74強毒通過肌肉注射途徑進行攻 毒（IX10巧IDs。/ 只）。
[0147] W上結(jié)果表明，MG7-NPA18+F-ut標記疫苗一次免疫維雞即可誘導高水平的保護 性抗體，具有良好的保護效果。
[0148] 實施例4MG7-NPA 18+F-ut標記疫苗株和LaSota株免疫攻毒后排毒實驗
[0149] 1、實驗方法
[0150] 為測定本發(fā)明實施例2利用反向遺傳操作系統(tǒng)救獲的MG7-NP A 18+F-ut標 記疫苗株（微生物保藏編號為；CCTCC NO ;V201505)免疫攻毒后的排毒情況，將SPF 雞分別免疫MG7-NP A 18+Fmut(300 y L，皮下注射）、LaSota(300 y L，皮下注射）、 MG7-NP A 18+F-ut (20 y L，肌注）和LaSota (20 y L，肌注）。病毒量保持一致，均為 3. 16X 10巧1〇5。/100 y L(疫苗制備方法同實施例3)。免疫組和非免疫組分別飼養(yǎng)于空氣負 壓隔離器中。在免疫后21d用強毒NDV F48E9和NDWII-74(本發(fā)明人實驗室保存用種毒） W1 X 10巧IDs。劑量經(jīng)肌肉注射途徑進行攻毒，攻毒后的第2d、如、6d、8d和lOd分別采集 喉拭子和泄殖腔拭子，并在攻毒后第3d和6d每組殺3只雞，采集臟器。將拭子和臟器使用 SPF雞胚進行滴定，檢測病毒的排毒情況和臟器帶毒情況。
[0151] 2、實驗結(jié)果
[0152] 分別用NDV F48E9毒株和NDV VII-74攻毒后檢測排毒情況，結(jié)果表明，LaSota免 疫組雞只的拭子病毒排毒檢出率高于MG7-NP A 18+F-ut組（表7和表8) ;LaSota免疫組雞 只的臟器帶毒檢出率高于MG7-NP A 18+F?t組（表9和表10)。
[015引表7 MG7-NPA18+F-ut株和LaSota株免疫后攻毒（F48E9株）檢測排毒結(jié)果[0巧4]
[0155]表8MG7-NPA18+F-ut株和LaSota株免疫后攻毒（NDVVII-74)檢測排毒結(jié)果
[0巧6]
[0157]表9MG7-NPA18+F-ut株免疫后攻毒（F48E9株）檢測臟器帶毒結(jié)果 [0巧引
[0159] 表10MG7-NPA18+F-ut株免疫后攻毒（NDVVII-74)檢測臟器帶毒結(jié)果
[0160]
【主權(quán)項】
1. 一株基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NP A 18+Fmut，其特征在于，其微生物保 藏編號為：CCTCC NO :V201505。2. 按照權(quán)利要求1所述的基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NP A 18+Fmut，其特 征在于：其全基因的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示。3. -種權(quán)利要求1或2所述基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NP A 18+Fmut的構(gòu) 建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 構(gòu)建基因VII型新城疫病毒G7株基因組全長cDNA質(zhì)粒prG7 ; (2) 在prG7基礎(chǔ)上將NP蛋白第443-460位18個氨基酸進行缺失突變，且將F蛋白裂 解位點第112-117位的氨基酸序列突變?yōu)镚RQGRL，構(gòu)建突變質(zhì)粒pMG7-NP A 18+Fmut; (3) 將突變質(zhì)粒pMG7-NP A 18+Fmut與輔助質(zhì)粒pBSK-NP、pBSK-P和pBSK-L共轉(zhuǎn)染痘病 毒感染后的BHK-21細胞，培養(yǎng)72h ;然后將細胞刮下，與細胞上清混合過濾后，接種9-11日 齡SPF雞胚，收獲病毒液，即得。4. 權(quán)利要求1所述的基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NP A 18+Fmut在制備新城 疫疫苗中的應用。5. -種預防新城疫的疫苗組合物，其特征在于，包括：免疫有效量的權(quán)利要求1所述基 因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NP A 18+Fmut和藥學上可接受的佐劑。6. -種基因VII型新城疫疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將權(quán)利要求1所述基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NP A 18+Fmut進行增殖， 收獲病毒液，滅活； (2) 向滅活后的病毒液中加入吐溫-80,制備水相； (3) 將水相與油相混合，乳化，即得。7. 按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)所述滅活是采用甲醛溶液 滅活病毒液；37°C滅活16h。8. 按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：病毒液中甲醛溶液的終濃度為 0? 15%〇9. 按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：按照體積比計，步驟（2)吐溫-80的 加入量為水相體積的4% ;步驟（3)水相與油相的比例為1 :2。10. 由權(quán)利要求6至9任何一項所述制備方法制備得到的新城疫疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明公開了基因VII型新城疫病毒標記疫苗株及其應用，屬于基因VII型新城疫病毒標記疫苗株的拯救及應用領(lǐng)域。本發(fā)明利用已建立的新城疫病毒反向遺傳操作平臺，將G7株的NP蛋白缺失18個氨基酸并將F蛋白裂解位點進行突變，通過篩選救獲一株毒力高度致弱、病毒滴度高的基因VII型新城疫病毒標記疫苗株MG7-NPΔ18+Fmut，其微生物保藏編號為：CCTCC NO：V201505。本發(fā)明標記疫苗株在雞胚中具有高生長滴度和低致病力的生物學特性且遺傳穩(wěn)定。免疫保護試驗結(jié)果表明，該標記疫苗株免疫原性好，可誘導高水平的保護性抗體，對免疫雞只實現(xiàn)完全保護，能用于防控目前流行的基因VII型新城疫病毒，并為鑒別疫苗免疫和野毒感染奠定基礎(chǔ)。CCTCC NO：V20150520150114
【IPC分類】A61P31/14, C12N7/00, C12R1/93, A61K39/17
【公開號】CN104988124
【申請?zhí)枴緾N201510230344
【發(fā)明人】朱啟運, 吉艷紅, 付鈺廣
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年5月7日