Pcsk9蛋白的d374y突變體在抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種PCSK9蛋白的D374Y突變體在抑制肝臟細(xì)胞 膽固醇流出中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素 9(proproteinconvertasesubtilisin-l;Lke/ kexintype9，PCS腳）是常染色體顯性遺傳高膽固醇血癥ADH(autosomaldominant hypercholesterolemia)的主效基因。PCSK9在肝臟的細(xì)胞的功能主要表現(xiàn)為對低密度脂 蛋白受體（low-densitylipoproteinrec巧tor,LDLR)的翻譯后調(diào)控作用；PCSK9分泌蛋 白能與肝細(xì)胞膜上LDLR相結(jié)合，介導(dǎo)PCSK9-LDLR復(fù)合體的胞內(nèi)溶酶體降解過程，而不影響 LDLR的內(nèi)吞作用和載脂蛋白B(apolipoproteinB，apoB)的合成，因此PCSK9的高表達(dá)或 功能獲得性突變與動(dòng)脈粥樣硬化疾病有直接的關(guān)系。
[0003] 目前的研究報(bào)道中未見PCSK9對肝臟細(xì)胞膽固醇外流影響的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種PCSK9蛋白的D374Y突變體在抑制肝臟細(xì)胞膽固醇 流出中的應(yīng)用。
[0005] 所述PCSK9蛋白的D374Y突變體具體為序列表中序列1所示蛋白質(zhì)；所述應(yīng)用具 體為在如下任一中的應(yīng)用：
[0006] (al)制備抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出的產(chǎn)品；
[0007] (a2)抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出；
[000引 （a3)下調(diào)ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋白表達(dá)量。
[0009] 編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)的基因（即所述PCSK9蛋白的D374Y突變體的編 碼基因）在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0010] (al)制備抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出的產(chǎn)品；
[0011] (a。抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出；
[001引 （a3)下調(diào)ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋白表達(dá)量。
[0013] 含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在如下任一中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0014] (al)制備抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出的產(chǎn)品；
[0015] (a2)抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出；
[0016] (a3)下調(diào)ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋白表達(dá)量。
[0017] 上述（a2)所示的應(yīng)用為非疾病診斷性應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出的產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明所提供的抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出和/或下調(diào)ABCA1蛋白和/或ABCG1蛋 白表達(dá)量的產(chǎn)品，其活性成分可為如下中至少一種：
[0020] (a)序列表中序列1所示蛋白質(zhì)；
[0021] 化）編碼序列表中序列1所不蛋白質(zhì)的基因；
[0022] (C)含有所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0023] 所述產(chǎn)品可為試劑盒。
[0024] W上所述基因可為如下中任一種：
[00幼 （1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[002引 似在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì) 的DNA分子；
[0027] 做與（1)或似限定的DNA序列具有90%W上同源性且編碼序列表中序列1所 示蛋白質(zhì)的DNA分子。
[002引上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0029] 所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述基因，W及轉(zhuǎn)錄終止序列組 成。
[0030] 在本發(fā)明中，所述重組載體為重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體為在 PCDNA3. 1(+)載體的多克隆位點(diǎn)處插入所述基因（序列2)后得到的重組質(zhì)粒。所述多克隆 位點(diǎn)具體為化ul和化〇1。
[0031] 所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為非繁殖材料。
[0032] 在本發(fā)明中，所述肝臟細(xì)胞為人源肝臟細(xì)胞，可為肝癌細(xì)胞，具體為化pG2細(xì)胞。
[0033] 在本發(fā)明中，所述抑制肝臟細(xì)胞膽固醇流出是通過下調(diào)ABCA1蛋白（序列5)和/ 或ABCG1蛋白（序列6)的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。
[0034] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種降低肝臟細(xì)胞膽固醇流出率的方法。
[0035] 本發(fā)明所提供的降低肝臟細(xì)胞膽固醇流出率的方法，具體可包括如下步驟；向目 的肝臟細(xì)胞中導(dǎo)入編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì)的基因，得到表達(dá)所述基因的重組肝臟 細(xì)胞；所述重組肝臟細(xì)胞的膽固醇流出率與所述目的肝臟細(xì)胞的膽固醇流出率相比降低。
[0036] 所述方法為非疾病診斷性方法。
[0037] 所述基因可為如下中任一種：
[00測 （1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[003引 似在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列1所示蛋白質(zhì) 的DNA分子；
[0040] 做與（1)或似限定的DNA序列具有90%W上同源性且編碼序列表中序列1所 示蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0041] 上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0042] 其中，所述基因是通過重組表達(dá)載體的形式導(dǎo)入所述目的肝臟細(xì)胞中的。所述重 組表達(dá)載體具體可為在PCDNA3. 1 (+)載體的多克隆位點(diǎn)化ul和化〇1處插入所述基因（序 列2)后得到的重組質(zhì)粒。
[004引在本發(fā)明中，所述肝臟細(xì)胞為人源肝臟細(xì)胞，可為肝癌細(xì)胞，具體為HepG2細(xì)胞。
[0044] 本發(fā)明利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的過表達(dá)載體結(jié)合G418藥物篩選實(shí)現(xiàn)PCSK9蛋白的D374Y 突變體在化pG2細(xì)胞中的穩(wěn)定高表達(dá)，并對該細(xì)胞的膽固醇流出能力進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)證 明，PCSK9蛋白的D374Y突變體過表達(dá)顯著抑制HepG2細(xì)胞的膽固醇流出率；PCSK9蛋白的 D374Y突變體對肝臟細(xì)胞的膽固醇流出的抑制是通過下調(diào)ABCA1蛋白、ABCG1蛋白的表達(dá)量 起作用的。本發(fā)明對研究肝臟細(xì)胞膽固醇代謝具有重要意義。
【附圖說明】
[0045] 圖1為人PCSK9基因在化pG2細(xì)胞中的過表達(dá)檢測。A為PCSK9過表達(dá)載體在 化pG2細(xì)胞中的翻譯水平檢測；PCDNA3. 1 (+)-D374Y表示連接PCS腳-D374Y突變體序列的過 表達(dá)質(zhì)粒；control表示PCDNA3. 1 (+)空載體對照組；內(nèi)參為GAPDH。B為化pG2細(xì)胞培養(yǎng) 液中PCSK9濃度的化ISA檢測。*林，P< 0. 001。
[0046] 圖2為PCSK9過表達(dá)對化pG2膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。A為22-NBD-膽固醇解育時(shí) 間和HepG2巧光強(qiáng)度的關(guān)系（PCDNA3. 1 (+)-NC組），其中control指的是化。B為皿L處 理時(shí)間與膽固醇流出的關(guān)系（PCDNA3. 1 (+)-NC組）。C為皿L濃度與膽固醇流出的關(guān)系 (PCDNA3. 1 (+) -NC組），其中control指的是0yg。D和E為PCSK9過表達(dá)對化pG2膽固醇 轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。D是膽固醇流出率的柱狀統(tǒng)計(jì)圖；E為細(xì)胞流式峰圖，指示膽固醇流出過程中 平均巧光強(qiáng)度曲線的偏離幅度。線1表示化pG2背景巧光強(qiáng)度，線2表示22-NBD-膽固醇 解育化，即膽固醇流出起始時(shí)間點(diǎn)，線3表示繼解育巧光膽固醇化后用皿L處理化，整個(gè) 實(shí)驗(yàn)過程為化。巧光強(qiáng)度指示細(xì)胞內(nèi)巧光標(biāo)記膽固醇的含量。F為PCSK9過表達(dá)對化pG2 膽固醇吸收能力的影響。"NC"為PCDNA3.l(+)-NC的縮寫，叩374Y"為PCDNA3.l(+)-D374Y 的縮寫。pcDNA3. 1 (+)-D374Y、pcDNA3. 1 (+)-NC分別表示連接PCS腳-D374Y突變體序列和 NC空白質(zhì)粒。*，P< 0. 05, *林，P< 0. 001，林林，P< 0. 0001。
[0047] 圖3為膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的檢測。PN、PD分別表示PCDNA3. 1空白載體、 PCDNA3.l(+)-D374Y。內(nèi)參為e-actin。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0049] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0050] HepG2細(xì)胞；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中屯、產(chǎn)品，資源編號： 3111C0001CCC000035。記載于"王叢叢.ATF6在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的化pG2細(xì)胞自瞻與調(diào)亡 中作用機(jī)制的研究.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014年博±論文"一文。
[0051] PCDNA3. 1(+)載體；lifetechnologies公司產(chǎn)品，貨號為；V790-20。
[0052] MEM肥AA，DMEM，F(xiàn)BS，Tiypsin-EDTA，Glutamax，Pen-str巧，Sodiumpyruvate; Gibco;AmaxaBasicNucleofectorKit，Lonza;Anti_mouseIgG，HRP，Anti-rabbitIgG， HRP,anti-P-actin，anti-ABCGl,anti-ABCAl,anti-SR-BI;CST;anti-PCS腳；Circulex; HumanPCS腳ELISAKit;Cir州Lex;22-NBD-膽固醇；Lifetechnology。
[0053] 實(shí)施例1、人PCSK9基因D374Y突變體過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0054] 本發(fā)明設(shè)及人PCSK9基因D374Y突變體序列（Genebank;NM_174936,1120bp處的 G突變?yōu)門，使天冬氨酸密碼子GAC突變?yōu)槔野彼岬拿艽a子TAC)。PCSK9基因野生型的核巧 酸序列具體為序列表中序列4所示，編碼序列表中序列3所示的野生型PCSK9蛋白。PCSK9 基因的D374Y突變體序列的核巧酸序列具體為序列表中序列2所示，編碼序列表中序列1 所示的PCSK9蛋白的D374Y突變體。
[005引本實(shí)施例將PCSK9基因的D374Y突變體序列（序列2)插入到PCDNA3. 1 (+)載體 的多克隆位點(diǎn)化ul和化01之間構(gòu)建成重組表達(dá)載體PCDNA3. 1 (+)-D374Y。
[0056] 重組載體的構(gòu)建由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。對所得重組質(zhì)粒進(jìn)行測序 驗(yàn)證。將經(jīng)測序表明在PCDNA3. 1 (+)載體的多克隆位點(diǎn)化ul和化〇1之間插入了序列表中 序列2所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為PCDNA3. 1 (+)-D374Y。
[0057] 實(shí)施例2、人PCSK9基因D374Y突變體過表達(dá)載體在化pG2細(xì)胞中的正常翻譯和分 泌
[0058] 為了驗(yàn)證PCSK9基因的D374Y突變體過表達(dá)載體的工作效率，將實(shí)施例1構(gòu)建獲 得的重組表達(dá)載體PCDNA3. 1 (+) -D3