一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型及其建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型及其建立方法，尤其設(shè)及一種小鼠胚胎 干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為具有搏動(dòng)能力的屯、肌細(xì)胞，并在所獲得的屯、肌細(xì)胞上建立化學(xué)品胚 胎毒性的識(shí)別和預(yù)測(cè)模型，并應(yīng)用于新化學(xué)品胚胎毒性的預(yù)測(cè)中。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，化學(xué)品的毒性數(shù)據(jù)多在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中獲得，如急性毒性試驗(yàn)，亞急性毒性試 驗(yàn)，慢性毒性試驗(yàn)等。但是，開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在幾個(gè)不容忽視的問(wèn)題；1.需要大量的財(cái)力， 2.實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，3.需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，4.因體內(nèi)影響因素較多，難W進(jìn)行代謝和機(jī)制 研究。出于動(dòng)物保護(hù)原則，Russell和Burch提倡"3R"原則，即減少（Reduction),優(yōu)化 化efinement)和替代化巧lacement)，無(wú)論是從科學(xué)角度還是從經(jīng)濟(jì)角度，毒理學(xué)替代法 對(duì)外源性化學(xué)物的危害評(píng)價(jià)及管理都有非常重要的意義。
[0003] 據(jù)歐洲化學(xué)品管理、評(píng)估和限制機(jī)構(gòu)（REACH)估計(jì)，接下來(lái)的15年中將會(huì)有30000 種化學(xué)品需要進(jìn)行安全性測(cè)試，根據(jù)現(xiàn)有的測(cè)試指南，將犧牲7百萬(wàn)只動(dòng)物，其中約64%是 用于化學(xué)品的生殖和發(fā)育毒性評(píng)價(jià)；每檢測(cè)2000種新化合物的發(fā)育毒性，約需耗資6億歐 元。而新化合物的數(shù)目W每年1000種遞增，其中90%W上沒(méi)有安全性評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)。在該 一過(guò)程中，無(wú)論是動(dòng)物的使用情況，還是測(cè)試過(guò)程中人力、物力、財(cái)力的消耗，如此巨大的數(shù) 字，讓人觸目驚屯、。
[0004] 我國(guó)幅員迂闊，人口眾多，因此在面臨評(píng)價(jià)化合物暴露導(dǎo)致的健康問(wèn)題時(shí)情況將 比其他國(guó)家更為復(fù)雜。并且由于各地化合物種類、比例不同，在開(kāi)展流行病學(xué)調(diào)查的時(shí)候重 點(diǎn)也不相同，加上工業(yè)快速發(fā)展、城市化進(jìn)程加快的同時(shí)也帶來(lái)了新型污染物及其快速擴(kuò) 散的問(wèn)題。毒理學(xué)替代法的應(yīng)用與推廣同樣適用于我國(guó)的國(guó)情。
[0005]自1986年歐盟實(shí)施動(dòng)物福利指導(dǎo)原則W來(lái)，歐盟大力支持替代法的發(fā)展與使用。 胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)巧ST)是經(jīng)過(guò)歐洲替代方法研究中屯、巧U化-ECVAM)驗(yàn)證的一類用于預(yù)測(cè) 化合物潛在胚胎毒性的實(shí)驗(yàn)方法。該方法充分利用了胚胎干細(xì)胞的分化潛能，設(shè)置分化的 觀察終點(diǎn)，結(jié)合細(xì)胞的一般毒理學(xué)數(shù)據(jù)，通過(guò)判別方程式對(duì)化合物的潛在胚胎毒性進(jìn)行評(píng) 估和分級(jí)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物的安全性評(píng)價(jià)，屬于一種測(cè)試方法的替代體系。借助EST，在 誘導(dǎo)的不同階段或不同的誘導(dǎo)方向進(jìn)行化學(xué)品的暴露，可模擬反應(yīng)分化過(guò)程中化合物對(duì)機(jī) 體發(fā)育的影響，在毒性篩選、毒性祀器官確定、毒性作用機(jī)制等毒理學(xué)研究中具有獨(dú)特的優(yōu) 勢(shì)。隨著國(guó)際上干細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷深化，胚胎干細(xì)胞模型也得到進(jìn)一步發(fā)展，即利 用其分化潛能尋找祀器官或監(jiān)測(cè)分化過(guò)程中關(guān)鍵基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)化合物對(duì)肝臟、肌肉、血 管、骨等器官組織的影響，通過(guò)選擇多個(gè)觀察終點(diǎn)，可W分別評(píng)估化合物對(duì)相應(yīng)器官組織的 潛在毒性。整個(gè)評(píng)估周期在10至21天之間，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都不需要用到活體的 動(dòng)物，節(jié)約人力、物力、財(cái)力和時(shí)間，可重復(fù)性強(qiáng)，易于操作，符合國(guó)際上化合物毒性評(píng)價(jià)替 代研究的要求，因而引起廣泛的關(guān)注。
[0006]EST適用于從細(xì)胞水平分析發(fā)育過(guò)程，并判斷某因素是否具備胚胎毒物或致崎潛 能。目前，EST多選擇屯、肌細(xì)胞作為分化發(fā)育后的衡量指標(biāo)，其原因有第一、屯、臟發(fā)育始于 胚胎發(fā)育早期，使得在體外通過(guò)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞（簡(jiǎn)稱ES或者ESC)分化為屯、肌細(xì)胞模擬 體內(nèi)的屯、臟發(fā)育過(guò)程較易實(shí)現(xiàn)；第二、屯、臟發(fā)育是一個(gè)高度特化的過(guò)程，對(duì)發(fā)育過(guò)程的細(xì)微 干擾即可導(dǎo)致屯、臟發(fā)育出現(xiàn)異常，因而具備較高的靈敏度；第S、由于ES誘導(dǎo)分化的屯、肌 細(xì)胞具有搏動(dòng)能力，作為觀測(cè)終點(diǎn)具有良好的可視性。
[0007] 為了驗(yàn)證EST的準(zhǔn)確性，Scholz進(jìn)行了W下實(shí)驗(yàn)；1.受試物對(duì)分化的3T3成纖維 細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)；2.受試物對(duì)未分化的ES細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)；3.受試物對(duì)ES細(xì)胞 向屯、肌細(xì)胞分化的影響。W相應(yīng)的體內(nèi)試驗(yàn)資料作為根據(jù)，在10種受試物中，100%準(zhǔn)確地 判斷了非胚胎毒性物質(zhì)，88. 9%準(zhǔn)確地判斷了弱胚胎毒性物質(zhì)，91. 7%準(zhǔn)確地判斷了強(qiáng)胚 胎毒性物質(zhì)。在此實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，結(jié)合受試物的體內(nèi)試驗(yàn)信息，Genschow等建立了判別 方程模型，對(duì)化合物的胚胎毒性開(kāi)展=級(jí)預(yù)測(cè)，即判斷化合物為無(wú)胚胎毒性、低胚胎毒性或 者高胚胎毒性。EST具備篩選化合物胚胎毒性的功能，因此被世界各大化學(xué)品制造商、藥廠 等用于對(duì)新原料或新藥的篩選及胚胎毒性的安全性測(cè)試。
[0008] 國(guó)際上許多致力于優(yōu)化EST的科學(xué)家通過(guò)大量的研究，提出了EST的標(biāo)準(zhǔn)化操作 流程中存在W下兩點(diǎn)亟待優(yōu)化的地方；第一、EST是基于ES細(xì)胞系D3建立和推廣的，建議 同時(shí)采用其他ES細(xì)胞系建立模型，保證評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性；第二、觀測(cè)屯、肌細(xì)胞的搏動(dòng)受 主觀因素影響較大，因此建議W分子生物學(xué)指標(biāo)作為觀測(cè)終點(diǎn)，W提高準(zhǔn)確度。
[0009] 目前，除了D3細(xì)胞系外，在其他的研究中，J1，R1，E14TG2a，E14. 1，DBA/llacZ等 ES細(xì)胞系也被使用，并發(fā)現(xiàn)了不同細(xì)胞系對(duì)誘導(dǎo)分化的敏感性不同，并造成了分化為具搏 動(dòng)能力屯、肌的時(shí)間存在差異。然而，該些已使用的ES細(xì)胞系核型均為XY，即都是"雄性"的 ES。當(dāng)前尚無(wú)利用核型為XX的ES細(xì)胞系建立胚胎毒性評(píng)價(jià)模型并開(kāi)展應(yīng)用的先例。
[0010] 利用分子生物學(xué)手段檢測(cè)關(guān)鍵的特異性基因在ES誘導(dǎo)的屯、肌細(xì)胞中的表達(dá)可更 精確地建立劑量一效應(yīng)曲線，在Seiler等人的實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)調(diào)了利用分子觀測(cè)終點(diǎn)獲得受試 化合物抑制屯、臟發(fā)育的相關(guān)數(shù)據(jù)，獲得了良好的劑量一效應(yīng)曲線W及與傳統(tǒng)觀測(cè)終點(diǎn)在評(píng) 價(jià)結(jié)果中的一致性。然而，當(dāng)前已有的EST僅采用編碼屯、肌蛋白重鏈的基因Myh6作為分子 觀測(cè)終點(diǎn)，其他的基因的表達(dá)情況是否也能作為可用于EST預(yù)測(cè)化學(xué)品胚胎毒性的分子觀 測(cè)終點(diǎn)，仍待確證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了彌補(bǔ)上訴現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明公開(kāi)了一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模 型，包括細(xì)胞種類；該細(xì)胞種類包括核型為XX的SP3ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的屯、肌細(xì)胞。
[001引進(jìn)一步地，還包括分子觀測(cè)終點(diǎn)；該分子觀測(cè)終點(diǎn)包括Myl4。
[0013] 進(jìn)一步地，該細(xì)胞種類還包括核型為XY的R1ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的屯、肌細(xì)胞。
[0014] 進(jìn)一步地，該分子觀測(cè)終點(diǎn)還包括cTnT和/或Myh6。
[00巧]進(jìn)一步地，還包括Myl4的上游引物序列；AAGAAACCCGAGCCTAAGAAGG，和Myl4的下 游引物序列；TGGGTCAAAGGCAGAGTCCT。
[0016] 進(jìn)一步地，還包括cTnT的上游引物序列；CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG，cTnT的下游引 物序列；CTCCATCGGGGATCTTGGGT，Myh6 的上游引物序列；GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和Myh6 的 下游引物序列；GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC。
[0017] 本發(fā)明還揭示了如上所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的建立方法，其特征在于， 包括W下步驟：
[001引步驟一：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；
[001引步驟二：小鼠ES的體外擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0020] 步驟立；小鼠ES的核型分析及性別鑒定；
[0021] 步驟四：小鼠ES多能性的維持和鑒定；
[0022] 步驟五：小鼠ES體外誘導(dǎo)分化為屯、肌細(xì)胞；
[0023] 步驟六：小鼠ES誘導(dǎo)分化的屯、肌細(xì)胞的屯、肌特異性標(biāo)志蛋白的免疫化學(xué)檢測(cè)；
[0024] 步驟^;：;小鼠ES誘導(dǎo)分化的屯、肌細(xì)胞的表達(dá)譜的Real-timePCR檢測(cè)；
[0025] 步驟八；模式化合物的選擇；選擇4種及W上模式化合物使得該模式化合物集合 包含強(qiáng)致崎性化合物、弱智崎性化合物、無(wú)致崎性化合物W及在雌雄性別中致崎性有所不 同的化合物；
[0026] 步驟九：模式化合物細(xì)胞毒性的檢測(cè)；獲得各模式化合物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死劑量 1〔50;
[0027] 步驟十；模式化合物對(duì)ES分化能力的抑制效應(yīng)的檢測(cè)；獲得各模式化合物對(duì)ES 細(xì)胞分化的半數(shù)抑制劑量1町。的值；
[0028] 步驟十一；模式化合物胚胎毒性的評(píng)價(jià)：通過(guò)步驟九得到的ICg。和步驟十得到的 1町。分析各模式化合物對(duì)胚胎毒性的影響程度，建立得到所述化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，從 而推廣到對(duì)其他化學(xué)品胚胎毒性的預(yù)測(cè)；
[0029] 所述ES包括SP3ES細(xì)胞。
[0030] 進(jìn)一步地，還包括步驟十二；分子觀測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀測(cè)終點(diǎn)用于反映模式化合物 對(duì)ES分化能力的抑制作用下的相關(guān)性分析，即采用SPSS19. 0軟件的配對(duì)散點(diǎn)圖功能對(duì)分 子觀測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀測(cè)終點(diǎn)用于測(cè)量半數(shù)分化抑制能力間的相關(guān)性進(jìn)行分析，同時(shí)計(jì)算決 定系數(shù)；當(dāng)分子觀測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀測(cè)終點(diǎn)間決定系數(shù)大于0. 9時(shí)，分子觀測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀 測(cè)終點(diǎn)高度相關(guān)性；W此判斷所述化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性和有效性。
[0031] 進(jìn)一步地，所述步驟六中所述的屯、肌特異性標(biāo)志蛋白包括cTnT;所述步驟走中的 所述表達(dá)譜包括Myh6、Myl4和cTnT基因；所述步驟八中的所述模式化合物包括5-氣尿喀 晚、阿司匹林、嘲噪美辛、抗壞血酸、青霉素G;所述步驟四中包括WNIH3T3成纖維細(xì)胞為 對(duì)照；所述ES還包括R1ES細(xì)胞。
[0032] 進(jìn)一步地，所述步驟九中獲得各模式化合物對(duì)3T3細(xì)胞和ES細(xì)胞的半數(shù)致死劑量 IC^3T3和ICwES;所述步驟十中獲得各模式化合物對(duì)ES細(xì)胞分化的半數(shù)抑制劑量1化。的 值；所述步驟十一中通過(guò)將所述ICw3T3、ICsnES和IDs。數(shù)據(jù)代