毒區(qū)域。切除子宮頸和血管后放入1號皿中。
[0104] (4)分別剪開各個胚胎間的子宮組織，將各胚胎放入2號皿中，用綴子將胚胎從子 宮片中擠出，用PBS洗凈胚胎上的母血細胞后，用綴子操作，去除胚胎的內(nèi)臟、四肢和頸部 W上部分，放入3號皿中。
[0105] 腳在超凈臺中用消毒后的手術剪將各胚體軀干部分充分剪碎后，用適量預熱的 0. 25%膜蛋白酶消化5分鐘后，按1:2比例加入滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)液終止消化。
[0106] 做用10ml移液管將消化后的組織塊及細胞轉(zhuǎn)入15ml無菌離屯、管中，輕輕吹吸幾 次后，放入臺式離屯、機中，按800轉(zhuǎn)/分鐘，21°C的條件離屯、5分鐘。
[0107] 口偈屯、結束后棄上清。用10ml培養(yǎng)液重懸細胞，轉(zhuǎn)入100mm直徑的細胞培養(yǎng)皿中， 標記為0代，置于37°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0108] 1. 2MEF的傳代及凍存；
[0109] (1)每天在光鏡下觀察細胞，待鋪滿培養(yǎng)皿（約48小時）后進行傳代。
[0110] (2)吸凈培養(yǎng)液，用高溫高壓滅菌后的PBS清洗并吸出，隨后加入3ml預熱的 0.25%膜蛋白酶，置于37°C培養(yǎng)箱中，1分30秒后取出后，按1:2比例加入培養(yǎng)液終止消 化，并轉(zhuǎn)入15ml離屯、管，在800轉(zhuǎn)/分鐘，21°C的條件下離屯、5分鐘。
[0111] 做離屯、結束后棄上清。用9ml培養(yǎng)液重懸細胞，按1 ;3比例轉(zhuǎn)入3個100mm直 徑的細胞培養(yǎng)皿中，補足培養(yǎng)液至沒過培養(yǎng)皿底部，標記為1代，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。
[0112] (4)重復前3個步驟對細胞進行傳代，并標記為2代。
[0113] (5)由于MEF細胞第3至5代適用于作為胚胎干細胞的滋養(yǎng)層細胞，因此對需要培 養(yǎng)的部分細胞進行傳代和后續(xù)操作，對其余細胞進行凍存操作，待后需使用時再進行復蘇。
[0114] (6)按上述步驟消化、重懸細胞后，對細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度為2x106細胞/ml, 離屯、后棄上清，并加入等量凍存液（凍存液配方為99. 25%FBS+0. 75%DMS0)，輕彈混勻后， 向每個凍存管中加入1ml細胞懸液，蓋好，在管外壁標注細胞種類、代數(shù)、日期、凍存者名字 等信息，用紙包裹凍存管并置于-80°C冰箱中過夜后，放入液氮罐中凍存。
[011引實施例2;小鼠ES的體外擴增培養(yǎng)
[0116] 2.1滋養(yǎng)層細胞的準備
[0117] (1)選擇代數(shù)適合、密度合適的MEF細胞，按10yg/ml工作濃度，在細胞培養(yǎng)液中 加入絲裂霉素C，混勻后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0118] (2) 2小時后吸凈含絲裂霉素C的培養(yǎng)液，并用高溫高壓滅菌后的PBS清洗5次，每 次5分鐘。
[0119] (3)洗凈后更換新鮮培養(yǎng)液，進行復蘇ES細胞或繼續(xù)培養(yǎng)操作。處理后的滋養(yǎng)層 細胞在5天內(nèi)均可支持小鼠ES細胞的生長和未分化狀態(tài)的維持。
[0120] 2. 2ES細胞的復蘇
[0121] (1)從液氮中取出ES細胞凍存管，放于37°C水浴鍋中溶解，待溶解至小冰晶狀態(tài) 時取出，滅菌處理后放入超凈臺。
[012引 似打開凍存管后，按1 ;1比例加入細胞培養(yǎng)液，加入后凍存液完全融化，輕輕吹 打培養(yǎng)液，并轉(zhuǎn)入15ml離屯、管中，800轉(zhuǎn)/min, 2rC離屯、5分鐘后，棄上清，加5mlES培養(yǎng) 液重懸為單細胞懸液。注意吹打過程中應避免氣泡的產(chǎn)生。
[0123] (3)吸盡MEF滋養(yǎng)層細胞中的培養(yǎng)液，將ES細胞懸液轉(zhuǎn)入滋養(yǎng)層后再加5m化S培 養(yǎng)液。
[0124] (4)每天在光鏡下觀察胚胎干細胞克隆的形成情況，每天半量換液；待長至70% 左右時進行傳代。
[01巧](5)此步驟分別復蘇20至25代間的ESR1細胞和ESSP3細胞，W用于后續(xù)實驗。
[0126] 2. 3滋養(yǎng)層的去除
[0127] 待ES細胞通過克隆的形式增殖至所需數(shù)量時，可通過差速貼壁法去除滋養(yǎng)層細 胞，保證用于后續(xù)實驗的ES細胞純度。差速貼壁法的原理是利用混合類型細胞貼壁性能的 差異，通過控制貼壁時間W從混合類型細胞中獲取目的細胞。步驟如下：
[012引 （1)預鋪0. 1%明膠于一個100mm直徑細胞培養(yǎng)皿中，于細胞培養(yǎng)箱中放置30分 鐘及W上，取出后吸盡剩余液體備用。
[0129] (2)當ES細胞在滋養(yǎng)層上長至合適密度時，用3ml37°C預熱的0.25%膜蛋白酶消 化為單細胞后，用6ml培養(yǎng)液重懸，按1 ;3比例傳至明膠包被的細胞培養(yǎng)皿中，并適當補充 培養(yǎng)液至剛沒過培養(yǎng)皿底，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0130] (3)1小時后取出培養(yǎng)皿，收集上部液體，離屯、棄上清后用ES培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)入明 膠包被的培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。此部分細胞即為純度較高的ES細胞。
[0131] 滋養(yǎng)層細胞及R1ES細胞培養(yǎng)見圖1。滋養(yǎng)層細胞及SP3ES細胞培養(yǎng)見圖2。
[013引實施例3;小鼠ES的核型分析及性別鑒定
[0133] 3.1核型分析
[0134] (1化5細胞培養(yǎng)于明膠包被的培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)至細胞覆蓋培養(yǎng)皿的面積大于80% 后進行后續(xù)操作；
[013引 （2)根據(jù)2. 4所述生長曲線結果，在對數(shù)生長期加入50ng/ml秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng) 2個小時。
[0136] (3)將培養(yǎng)液吸盡后加入邸TA-膜酶消化液，放置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中5分鐘后， 用移液器輕輕吹打，然后將細胞懸液收集到刻度離屯、管中，室溫下800轉(zhuǎn)/分鐘，離屯、5分 鐘。
[0137] (4)用移液器移除上清液，約留0. 1ml，隨后加入低滲溶液0. 56%w/v的KC1補至 1ml，至于水浴鍋中5分鐘。
[0138] (5)加入甲醇；冰醋酸=3 ;l(v/v)配置的固定液，室溫固定低滲處理后的細胞40 分鐘后，800轉(zhuǎn)/分，離屯、5分鐘后去除上清液，進行二次固定，二次固定時間為20分鐘，隨 后800轉(zhuǎn)/分，離屯、5分鐘后去除上清液。
[0139] (6)加入新鮮固定液0. 5ml后重懸，用移液器吸取混懸液，W 50cm的距離進行滴 片，然后放入65 °C恒溫干燥箱中烘烤過夜。
[0140] (7)將1ml Giemsa原液加入9ml PBS緩沖液中，配置成染色液。
[0141] 做從烤箱中取出玻片，加入染色液染色lOmin，沖洗，驚干。
[0142] (9)閱片，在顯微鏡下分析并記錄20個分裂相。
[0143] 結果顯示，化=40為小鼠胚胎干細胞的正常核型，實驗所用R1ES和SP3ES正常核 型率均大于50%。R1ES細胞的核型分析結果見圖3。SP3ES細胞的核型分析結果見圖4。
[0144] 3. 2性別鑒定
[0145] ES細胞培養(yǎng)于明膠包被的培養(yǎng)皿上，兩種性別的ES各收獲1 X 106個細胞， 用Qiagen FlexiGene DNA抽屜試劑盒提取基因組DNA。分別利用X染色體特異性基 因Zfx和Y染色體特異性基因Sry對兩個ES細胞系進行性別鑒定，Zfx的正向序列為 AAGAGAGTCCATTCAAGTGTGA，反向序列為GCTACCTTTGTTGCCGAAAT，退火溫度為58°C，退火時間 為35秒，循環(huán)數(shù)為31，擴增產(chǎn)物大小為399bp ;S巧的正向序列為CTTTTTCCAGGAGGCACAGA， 反向序列為GACAGGCTGCCAATAAAAGC，退火溫度為60°C，退火時間為35秒，循環(huán)數(shù)為31，擴增 產(chǎn)物大小為25化P。
[0146]PCR結果見圖5。R1ES細胞的PCR產(chǎn)物包括X染色體特異性基因Zfx和Y染色體 特異性基因S巧兩個條帶，故為XY，即雄性；SP3ES細胞的PCR產(chǎn)物只包括X染色體特異性 基因Zfx-個條帶，故為XX，即雌性。
[0147]實施例4;小鼠ES多能性的維持和鑒定[014引 4. 1形態(tài)觀察
[0149] 通過相差顯微鏡觀察ES細胞的生長特點和形態(tài)學特征，見圖1和圖2。
[0150] 4. 2堿性磯酸酶（簡稱AK巧染色
[OW] (1)配置5mllOOmmol/L的Tris?肥1，調(diào)抑至8. 2,按照試劑盒說明書，向其中加 入染色試劑后混勻備用；
[015引 （2)吸盡ES細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用高溫高壓滅菌的PBS清洗，5分鐘/次，共 3次，W去除培養(yǎng)液對染色效果的影響；
[0153] (3)將適量染色試劑加入培養(yǎng)皿中，避光于37°C培養(yǎng)箱中解育20分鐘；
[0154] (4)用PBS清洗后，加入4%的多聚甲醒，2分鐘后用PBST清洗，即可上鏡觀察。
[0155]R1ES細胞的堿性磯酸酶染色結果見圖6。SP3ES細胞的堿性磯酸酶染色結果見 圖7。WNIH3T3成纖維細胞為對照，其堿性磯酸酶染色結果見圖8。R1ES細胞，染色結果 呈陽性；SP3ES細胞，染色結果呈陽性；NIH3T3成纖維細胞，染色結果呈陰性。
[0156] 4. 3ES細胞多能性分子標記的檢測
[0157] 4. 3. 1ES細胞總RNA的提取
[015引 （1)收獲ES細胞前，吸盡培養(yǎng)液，用高溫高壓滅菌的PBS清洗細胞，5分鐘為1次， 共3次；
[0159] (2)吸盡PBS后向細胞培養(yǎng)皿中加入1mlTrizol試劑，充分混勻后轉(zhuǎn)至1. 5mlEP 管（不含RNA酶）中，按氯仿；Triozl(1:5)的比例加入氯仿，用力搖勻，置于冰上10分鐘；
[0160] (3)4°C，12000Xg，離屯、15分鐘，將上清轉(zhuǎn)入無RNA酶的1.5ml離屯、管中，按異丙 醇；上清（1:1)