85
[023。0) - 0. 1251g(IC503T：3) - 1. 9171g(IC50E巧+1. 500[aCs03T3 -ID50)/ICs03T：3] - 2. 67
[0232] 胚胎毒性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：
[023引若（1) >似且（1) > (3)，則判斷化合物為無(wú)發(fā)育毒性；
[0234]若似> (1)且似> (3)，則判斷化合物為弱發(fā)育毒性；
[023引若做>(1)且做>(2)，則判斷化合物為強(qiáng)發(fā)育毒性。
[0236] 各模式化合物的ICg。見(jiàn)表3、IDW值及胚胎毒性判斷結(jié)果參見(jiàn)表4。
[0237] 表3.模式化合物對(duì)不同細(xì)胞的ICs。值 [023引
[0239]
[0240] 表4.模式化合物對(duì)不同細(xì)胞的IDs。值及模式化合物的胚胎毒性判斷結(jié)果
[0241]
[0243] 如圖23所示，是本發(fā)明所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的一種較佳實(shí)施方式的 示意圖，其結(jié)合了實(shí)施例1-11，示出了其中的主要步驟；3T3細(xì)胞、R1ES細(xì)胞和SP3ES細(xì) 胞暴露于化合物，測(cè)得相應(yīng)的ICw;RlES細(xì)胞和SP3ES細(xì)胞分化過(guò)程中暴露于化合物，測(cè) 得相應(yīng)的1〇5。。通過(guò)ICg。和ID5。分析獲得相應(yīng)化合物的胚胎毒性預(yù)測(cè)結(jié)果。
[0244] 實(shí)施例12 ;分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)用于反映模式化合物對(duì)ES分化能力的 抑制作用下的相關(guān)性分析
[024引 ES細(xì)胞經(jīng)定向誘導(dǎo)后可分化為具有搏動(dòng)能力的屯、肌細(xì)胞，在檢測(cè)化合物對(duì)ES分 化能力的抑制作用時(shí)，通常在鏡下觀(guān)測(cè)搏動(dòng)能力在不同濃度的模式化合物的暴露下的變 化，從而計(jì)算半數(shù)分化抑制劑量。該一方法為傳統(tǒng)的觀(guān)測(cè)終點(diǎn)。然而，在觀(guān)測(cè)過(guò)程中，個(gè)體間 的主觀(guān)誤差和較大的工作量使得基于傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)的評(píng)價(jià)模型不利于高通量篩選的開(kāi)展， 因此，利用分子生物學(xué)終點(diǎn)替代傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)具有重大的應(yīng)用意義。
[0246] 本實(shí)施例將采用SPSS19. 0軟件的配對(duì)散點(diǎn)圖功能對(duì)分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終 點(diǎn)用于測(cè)量半數(shù)分化抑制能力間的相關(guān)性進(jìn)行分析，同時(shí)計(jì)算決定系數(shù)。通常認(rèn)為，兩指標(biāo) 間決定系數(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)R2)大于0. 9,即可證明兩指標(biāo)間的高度相關(guān)性。由圖24可見(jiàn)，在R1ES 細(xì)胞和SP3ES細(xì)胞中，傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和3個(gè)分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)Myh6,Myl4和cTnT之間的決定 系數(shù)分別為0. 944,0. 986,0. 987和0. 937,0. 902, 0. 965間均存在高度的相關(guān)性。
[0247] 綜上所述，在所選擇的模式化合物中，基于雄性R1ES細(xì)胞的模型和基于雌性SP3 ES細(xì)胞的模型對(duì)5-氣尿喀晚，嘲噪美辛，抗壞血酸，青霉素G的胚胎毒性的判斷結(jié)果一致， 并且與各模式化合物的背景信息一致；基于雄性R1ES細(xì)胞的模型和基于雌性SP3ES細(xì)胞 的模型對(duì)阿司匹林的胚胎毒性判斷結(jié)果存在差異，"雄性"模型判斷該化合物為弱胚胎毒性 化合物，與模式化合物的背景信息一致；"雌性"模型判斷該化合物為無(wú)胚胎毒性化合物，盡 管與"雄性"模型的判斷結(jié)果有差異，但與該化合物在雌性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的結(jié)果一致。由實(shí)施 例11和實(shí)施例12可見(jiàn)，采用分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)開(kāi)展的胚胎毒性評(píng)價(jià)結(jié)果與采用傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn) 開(kāi)展的胚胎毒性評(píng)價(jià)結(jié)果一致，所W，利用分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)替代傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)具有可行性。 [024引本發(fā)明設(shè)及的序列及記號(hào)分列如表5 [0249] 表5序列表
[0 巧 0]

。巧1]w上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無(wú) 需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可W根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可W得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書(shū)所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，其特征在于：包括細(xì)胞種類(lèi)；所述細(xì)胞種類(lèi)包括核 型為XX的SP3ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的心肌細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，其特征在于：還包括分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)； 所述分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)包括Myl4。3. 如權(quán)利要求1所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，其特征在于：所述細(xì)胞種類(lèi)還包括 核型為XY的RlES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的心肌細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求2所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，其特征在于：所述分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)還 包括cTnT和/或Myh6。5. 如權(quán)利要求2所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，其特征在于：還包括Myl4的上游引 物序列：AAGAAACCCGAGCCTAAGAAGG，和 Myl4 的下游引物序列：TGGGTCAAAGGCAGAGTCCT。6. 如權(quán)利要求5所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，其特征在于：還包括cTnT的上 游引物序列：CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG，cTnT 的下游引物序列：CTCCATCGGGGATCTTGGGT， Myh6的上游引物序列：GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和Myh6的下游引物序列： GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC。7. 如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的建立方法，其特征在于， 包括以下步驟： 步驟一：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)； 步驟二：小鼠ES的體外擴(kuò)增培養(yǎng)； 步驟三：小鼠ES的核型分析及性別鑒定； 步驟四：小鼠ES多能性的維持和鑒定； 步驟五：小鼠ES體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞； 步驟六：小鼠ES誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的心肌特異性標(biāo)志蛋白的免疫化學(xué)檢測(cè)； 步驟七：小鼠ES誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的表達(dá)譜的Real-time PCR檢測(cè)； 步驟八：模式化合物的選擇：選擇4種及以上模式化合物使得該模式化合物集合包含 強(qiáng)致畸性化合物、弱智畸性化合物、無(wú)致畸性化合物以及在雌雄性別中致畸性有所不同的 化合物； 步驟九：模式化合物細(xì)胞毒性的檢測(cè)：獲得各模式化合物對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死劑量IC5tl; 步驟十：模式化合物對(duì)ES分化能力的抑制效應(yīng)的檢測(cè)：獲得各模式化合物對(duì)ES細(xì)胞 分化的半數(shù)抑制劑量ID5tl的值； 步驟十一：模式化合物胚胎毒性的評(píng)價(jià)：通過(guò)步驟九得到的IC5tl和步驟十得到的ID 5(| 分析各模式化合物對(duì)胚胎毒性的影響程度，建立得到所述化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型，從而 推廣到對(duì)其他化學(xué)品胚胎毒性的預(yù)測(cè)； 所述ES包括SP3ES細(xì)胞。8. 如權(quán)利要求7所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的建立方法，其特征在于，還包括步 驟十二：分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)用于反映模式化合物對(duì)ES分化能力的抑制作用下 的相關(guān)性分析，即采用SPSS 19. O軟件的配對(duì)散點(diǎn)圖功能對(duì)分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn) 用于測(cè)量半數(shù)分化抑制能力間的相關(guān)性進(jìn)行分析，同時(shí)計(jì)算決定系數(shù)；當(dāng)分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和 傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)間決定系數(shù)大于0. 9時(shí)，分子觀(guān)測(cè)終點(diǎn)和傳統(tǒng)觀(guān)測(cè)終點(diǎn)高度相關(guān)性；以此判 斷所述化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性和有效性。9. 如權(quán)利要求7所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的建立方法，其特征在于，所述步驟 六中所述的心肌特異性標(biāo)志蛋白包括cTnT ;所述步驟七中的所述表達(dá)譜包括Myh6、Myl4和 cTnT基因；所述步驟八中的所述模式化合物包括5-氟尿嘧啶、阿司匹林、吲哚美辛、抗壞血 酸、青霉素G ;所述步驟四中包括以NIH 3T3成纖維細(xì)胞為對(duì)照；所述ES還包括RlES細(xì)胞。10. 如權(quán)利要求7所述的化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型的建立方法，其特征在于，所述步驟 九中獲得各模式化合物對(duì)3T3細(xì)胞和ES細(xì)胞的半數(shù)致死劑量IC 5(I3T3和IC5tlES ;所述步驟 十中獲得各模式化合物對(duì)ES細(xì)胞分化的半數(shù)抑制劑量ID5tl的值；所述步驟十一中通過(guò)將所 述IC 5Q3T3、IC5tlES和ID5tl數(shù)據(jù)代入下列判別式中： (1) 5. 9161g(IC503 T3)+3. 5001g (IC50ES) - 5. 307[(IC503T3 - ID50)/IC503 T3] - 15. 27 (2) 3. 6511g(IC503 T3)+2. 3941g (IC50ES) - 2. 033[(IC503T3 - ID50)/IC503 T3] - 6. 85 (3) - 0. 1251g (IC503T3) - I. 9171g (IC50ES) +1. 500 [ (IC503T3 - ID50) /IC503T3] - 2. 67 胚胎毒性判斷標(biāo)準(zhǔn)為： 若⑴ > ⑵且⑴> (3)，則判斷化合物為無(wú)發(fā)育毒性； 若⑵ > ⑴且⑵> (3)，則判斷化合物為弱發(fā)育毒性； 若（3) >⑴且（3) > (2)，則判斷化合物為強(qiáng)發(fā)育毒性。
【專(zhuān)利摘要】一種化學(xué)品胚胎毒性預(yù)測(cè)模型包括細(xì)胞種類(lèi)；該細(xì)胞種類(lèi)包括核型為XX的SP3ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的心肌細(xì)胞。其建立方法包括步驟一、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離和培養(yǎng)；二、小鼠ES的體外擴(kuò)增培養(yǎng)；三、小鼠ES的核型分析及性別鑒定；四、小鼠ES多能性的維持和鑒定；五、小鼠ES體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞；六、小鼠ES誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的心肌特異性標(biāo)志蛋白的免疫化學(xué)檢測(cè)；七、小鼠ES誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞的表達(dá)譜的Real-time PCR檢測(cè)；八、模式化合物的選擇；九、模式化合物細(xì)胞毒性的檢測(cè)；十、模式化合物對(duì)ES分化能力的抑制效應(yīng)的檢測(cè)；十一、模式化合物胚胎毒性的評(píng)價(jià)。填補(bǔ)EST體系中無(wú)雌性小鼠胚胎干細(xì)胞的空白。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/02, C12N5/077
【公開(kāi)號(hào)】CN104988116
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510478375
【發(fā)明人】王艷, 程薇, 胡慶亮, 張星
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年8月7日