基因vii型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因VII型新城疫病毒，尤其設(shè)及基因VII型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株 MG7-NPAIS+F-ut，本發(fā)明還設(shè)及所述MG7-NPA18+F-ut株在制備基因VII型新城疫疫苗中 的應(yīng)用，屬于基因VII型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株的捶救及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫是由新城疫病毒（NewcastleDiseaseVirus,NDV)引起的一種急性、高度 傳染性禽類疾病，主要侵害雞和火雞，是世界公認(rèn)的最重要的兩大禽類傳染病之一。
[0003] 當(dāng)前防控新城疫主要使用LaSota和化tcherB1兩種弱毒疫苗或其滅活疫苗，并 且它們作為疫苗毒株已經(jīng)應(yīng)用了幾十年。LaSota和化tcherB1兩毒株都屬于基因II型， 而中國當(dāng)前流行的毒株主要是基因VII型NDV。因此，上述兩種疫苗不能在臨床應(yīng)用上提供 堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)，該也解釋了新城疫依舊在一些地區(qū)流行的原因。
[0004] 不僅基因VII型NDV滅活疫苗的研制可為當(dāng)前新城疫提供有效的保護(hù)，而且國家 中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃中明確了新城疫是重點(diǎn)防治對象，最終通過區(qū)分感染與免疫的方 法達(dá)到新城疫凈化的目標(biāo)。因此，研制基因VII型新型NDV標(biāo)記疫苗具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建并獲得一株基因VII型NDV標(biāo)記疫苗株，該標(biāo) 記疫苗株的毒力高度減弱，在雞胚上具有高繁殖能力，免疫原性好，不僅能夠用于制造防控 目前流行的基因VII型NDV，而且能夠區(qū)分野毒感染和疫苗免疫。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明利用NDV反向遺傳操作平臺(tái)，將具有高繁殖性能的NDVG7分離株的NP蛋 白443-460位置缺失18個(gè)氨基酸并將F蛋白裂解位點(diǎn)112-117位置進(jìn)行突變，通過篩選， 最終獲救一株毒力高度致弱且毒價(jià)高的基因VII型NDV標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F-ut。
[000引本發(fā)明將獲得的基因VII型NDV標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F-ut提交專利認(rèn)可的機(jī) 構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號為；CCTCCNO;V201505 ;分類命名為；基因VII型新城疫病 毒NDVMG7-NPA18+F-ut。保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、；保藏時(shí)間是2015年1月 14日；保藏地址；中國武漢武漢大學(xué)。
[0009] 本發(fā)明還公開了一種所述基因VII型NDV標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F-ut的構(gòu)建方 法，包括W下步驟：
[0010] (1)構(gòu)建基因VII型NDVG7株基因組全長cDNA質(zhì)粒prG7 ;
[0011] (2)在prG7基礎(chǔ)上將NP蛋白第443-460位18個(gè)氨基酸進(jìn)行缺失突變，且將F蛋 白裂解位點(diǎn)第112-117位的氨基酸序列突變?yōu)镚RQG化，構(gòu)建突變質(zhì)粒PMG7-NPA18+F?t; [001引 （3)將突變質(zhì)粒PMG7-NPA18+F-ut與輔助質(zhì)粒地SK-NP、地SK-P和地SK-L共轉(zhuǎn) 染痘病毒感染后的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)72h;然后將細(xì)胞刮下，與細(xì)胞上清混合過濾后，接種 9-11日齡SPF雞胚，收獲病毒液，即得。
[0013] 其中，步驟（3)中選用0.IMOI劑量的痘病毒感染BHK-21細(xì)胞；所述培養(yǎng)方式為 37°C的C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0014] 本發(fā)明首先構(gòu)建NDVG7株基因組全長cDNA，在全長cDNA片段的5'末端前添 加T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，在全長cDNA片段末端加入具有自我催化功能的了肝病毒核酶序 列和T7轉(zhuǎn)錄終止信號；本發(fā)明同時(shí)在T7RNA聚合酶啟動(dòng)子與全長基因組cDNA的5'末端 之間引入兩個(gè)多余的G，該有助于副粘病毒反向遺傳操作的病毒捶救，構(gòu)建完成的質(zhì)粒命 名為prG7 ;在此基礎(chǔ)上，利用重疊PCR方法，分別將G7株NP蛋白443-460aa進(jìn)行缺失和 449-452aa進(jìn)行突變，獲得突變質(zhì)粒PMG7-NPA18和pMG7-Npmu"，然后分別與地SK-NP、 地SK-P和地SK-LS個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，獲得病毒株MG7-NPA18和 MG7-NP-U"株。病毒毒力指標(biāo)檢測結(jié)果表明，獲得的MG7-NPA18株、MG7-NPmu"株與G7株 相比，病毒毒力沒有明顯減弱。
[0015] 研究表明，NDV的毒力主要由F蛋白決定，強(qiáng)毒株F蛋白裂解位點(diǎn)為RRQKRF，而弱 毒株LaSota的F蛋白裂解位點(diǎn)為GRQG化。因此，本發(fā)明在PMG7-NPA18的基礎(chǔ)上，將F 蛋白裂解位點(diǎn)RRQKRF進(jìn)行突變，分別突變?yōu)镚RQG化、GRQKRF、RRQGRF和RRQK化，獲得突變 質(zhì)粒PMG7-NPA18+Fmut、pMG7-NPA18+Fmut-i、pMG7-NPA18+Fmut-2和PMG7-NPA18+Fmut-3， 然后分別與地SK-NP、地SK-P和地SK-LS個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，救獲標(biāo) 記疫苗株 4 株，分別命名為MG7-NPAIS+F-ut、MG7-NPAIS+F-ut-i、MG7-NPAIS+F-ut-2和 MG7-NPA18+F-化-3。
[0016] 獲救病毒在雞胚的生長特性及致病特性檢測結(jié)果表明，MG7-NPA18+F-ut株W 10巧1町。劑量尿囊腔內(nèi)接種9日齡SPF雞胚，在96小時(shí)內(nèi)無死胚；并在雞胚內(nèi)達(dá)到與G7株 相似的生長滴度，HA為29,EIDw為5. 62X10 7血；而其它突變株接種9日齡SPF雞胚后，雞 胚均在60h內(nèi)死亡。
[0017] 病毒毒力指數(shù)測定結(jié)果表明，MG7-NPA18+F-ut株的毒力明顯減弱，測得MDT> 12化，ICPI為0. 49,IVPI為0 ;而其它突變株與G7株相比，毒力沒有明顯減弱。由此可知， 本發(fā)明獲得一株減毒標(biāo)記疫苗株，為MG7-NPA18+F?t。
[0018] 對減毒標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F-ut遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果表明， MG7-NPA18+F-ut株用9日齡SPF雞胚傳代至第4代、第8代、第12代和第15代，各代突變 位點(diǎn)依然存在，遺傳穩(wěn)定性好；其全基因組核巧酸序列為SEQIDNo. 1所示。
[0019] 通過W上數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明利用反向遺傳操作技術(shù)救獲的MG7-NPA18+F-ut株在 雞胚中具有高生長滴度和低致病力的生物學(xué)特性，且遺傳穩(wěn)定。
[0020] 本發(fā)明所述基因VII型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F?t能夠用于制備基 因VII型新城疫疫苗。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種預(yù)防新城疫的疫苗組合物，包括：免疫有效量的基因 VII型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F-ut和藥學(xué)上可接受的佐劑。
[0022] 本發(fā)明還公開了一種基因VII型新城疫疫苗的制備方法，包括W下步驟；（1)將基 因VII型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F?t進(jìn)行增殖，收獲病毒液，滅活；(2)向滅活 后的病毒液中加入吐溫-80,制備水相；（3)將水相與油相混合，乳化，即得。
[0023] 其中，步驟（1)所述滅活是采用甲醒溶液滅活病毒液；37°C滅活16h。病毒液中甲 醒溶液的終濃度為0. 15%。
[0024] 按照體積比計(jì)，步驟（2)吐溫-80的加入量為水相體積的4% ;步驟（3)水相與油 相的比例為1 ;2 ;其中，所述油相為常用的油佐劑，包括白油佐劑、弗氏佐劑等。
[0025] 本發(fā)明還公開了所述制備方法制備得到的新城疫疫苗。
[0026] 免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MG7-NPA18+F-ut株制備的滅活疫苗對雞只安全且無副 反應(yīng)；免疫4周齡SPF維雞可誘導(dǎo)高水平的保護(hù)性抗體，免疫后第21d抗體效價(jià)為2& 5。免 疫后分別用NDVF48E9和NDVVII-74強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒，結(jié)果免疫雞只未出現(xiàn)任何發(fā)病或死 亡，可實(shí)現(xiàn)完全保護(hù)。免疫攻毒后排毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MG7-NPA18+F?t免疫組雞只的拭子 病毒排毒檢出率和臟器帶毒檢出率均低于LaSota免疫組，具有良好的保護(hù)效果。
[0027] 本發(fā)明救獲的MG7-NPA18+F-ut株作為疫苗株，其基因型與目前中國流行的基因 VII型新城疫相一致，可用于防控目前流行的基因VII型新城疫病毒，且能區(qū)分野毒感染和 疫苗免疫。
[002引本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下有益效果：
[0029] 本發(fā)明通過將具有高繁殖性能的G7株的NP蛋白443-460位置缺失18個(gè)氨基酸 及F蛋白裂解位點(diǎn)112-117位置突變?yōu)槿醵局闘aSota的F蛋白裂解位點(diǎn)GRQG化，獲救一株 基因VII型新城疫病毒標(biāo)記疫苗株MG7-NPA18+F?t。該標(biāo)記疫苗株在雞胚中具有高生長 滴度和低致病力的生物學(xué)特性，遺傳穩(wěn)定，免疫原性好，能夠用于制造防控目前流行的基因 VII型新城疫的同型疫苗，為鑒別新城疫疫苗免疫和野毒感染奠定基礎(chǔ)。
[0030] 本發(fā)巧所徙及到的術(shù)語定交
[0031] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0032] 可互換使用的術(shù)語"疫苗"或"疫苗組合物"指該樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可W保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可W包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可W另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可W包括W其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造